In anoxischen Grünalgenkulturen wird nach der Beleuchtung eine PSII-Photosynthesesteuerung aktiviert

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 514 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der photosynthetischen Wasserstoffproduktion aus Mikroalgen wird Potenzial als erneuerbare Energiequelle zugeschrieben. Der Prozess weist jedoch zwei wesentliche Einschränkungen auf, die ihn von einer Ausweitung abhalten. (i) Elektronenverlust durch konkurrierende Prozesse, hauptsächlich Kohlenstofffixierung, und (ii) Empfindlichkeit gegenüber O2, was die Expression und Aktivität des Hydrogenase-Enzyms verringert, das die H2-Produktion katalysiert. Hier berichten wir über eine dritte, bisher unbekannte Herausforderung: Wir fanden heraus, dass unter Sauerstoffmangel ein Verlangsamungsschalter im Photosystem II (PSII) aktiviert wird, der die maximale Photosyntheseproduktivität um das Dreifache verringert. Unter Verwendung von gereinigtem PSII und der Anwendung von spektroskopischen und massenspektrometrischen In-vivo-Techniken auf Chlamydomonas reinhardtii-Kulturen zeigen wir, dass dieser Schalter unter Anoxie innerhalb von 10 s nach der Beleuchtung aktiviert wird. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Wiederherstellung der ursprünglichen Geschwindigkeit nach 15 Minuten dunkler Anoxie erfolgt, und schlagen einen Mechanismus vor, bei dem die Modulation des Elektronentransfers an der Akzeptorstelle von PSII dessen Leistung verringert. Solche Einblicke in den Mechanismus erweitern unser Verständnis der anoxischen Photosynthese und ihrer Regulierung in Grünalgen und inspirieren neue Strategien zur Verbesserung der Bioenergieausbeute.

Der photosynthetische Elektronenfluss ist für die Entwicklung komplexen Lebens auf der Erde von entscheidender Bedeutung, da bei diesem Prozess Sonnenlicht als primäre Energiequelle für die meisten lebenden Organismen eingefangen wird. Dieser Prozess ist vor allem für seine Rolle bei der O2-Entwicklung durch das Photosystem II (PSII) von Cyanobakterien, Algen und Pflanzen bekannt1,2. Allerdings ist die Nutzung von Sonnenlicht als Primärenergiequelle zwar sehr effizient, aber nicht ohne Herausforderungen. Eines der Hauptprobleme, mit denen Pflanzen zu kämpfen haben, ist die Instabilität und Inkonsistenz der Bestrahlungsstärke. Um diese Probleme zu überwinden, haben Pflanzen ein ausgeklügeltes Netzwerk regulatorischer Prozesse entwickelt, die die Effizienz des Photosyntheseapparats steuern. Der Prozess des Elektronenflusses wird ständig reguliert, um Barrieren entsprechend der Verfügbarkeit von Metaboliten des Photosyntheseapparats zu umgehen. Es wurde postuliert, dass Redox-Gleichgewicht und Sublokalisierung von Komplexen in der Thylakoidmembran eine „photosynthetische Kontrolle“ darstellen und den Elektronenfluss aufrechterhalten, um ihn an die Kapazität des Systems anzupassen3,4. Grüne Mikroalgen, die ständig Umweltveränderungen ausgesetzt sind, haben außerdem mehrere Regulierungsmechanismen entwickelt, um mit schnellen Veränderungen der Lichtqualität und -intensität zurechtzukommen5. Diese Prozesse ermöglichen es Zellen, schnelle Übergänge aus der Dunkelheit zu bewältigen, da sie die Menge der verfügbaren Folgeprodukte beider Photosysteme erhöhen und so Einschränkungen auf der Akzeptorseite mildern. Wenn ein solcher Übergang jedoch unter Anaerobiose aufgrund der Atmung der Zellen oder der externen O2-Abfangung stattfindet, wird die H2-Entwicklung durch Hydrogenase, die sonst zur Inaktivierung durch O26 neigt, zum einzigen wirksamen Ventil, das mit einem Energieüberschuss zurechtkommt solche plötzlichen Lichtexpositionen7,8,9.

Die Produktion von H2 aus Grünalgen ist Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten, da H2 als potenzielle erneuerbare Energiequelle gilt. Kürzlich wurde ein möglicher Durchbruch in Richtung Skalierbarkeit erzielt, indem eine längere H2-Produktion in der Umgebungsluft nachgewiesen wurde10,11. Dementsprechend wurde gezeigt, dass die beiden größten Herausforderungen, die eine skalierbare H2-Produktion aus Grünalgen verhindert haben (Inaktivierung durch O2-Schaden und Konkurrenz mit der CO2-Fixierung12,13), lösbar sind. Tatsächlich wurde bereits zuvor gezeigt, dass die Belastung der Zellen mit schwankendem Licht im Bereich von Minuten oder darunter den O2-Wert auf niedrige Werte begrenzen und so die Nachhaltigkeit der H2-Produktion verbessern kann7,14,15. Solche Versuche beseitigten jedoch ein weiteres, noch nicht identifiziertes Hindernis für die H2-Entwicklung. Es wurde gezeigt, dass die anfängliche Lichteinwirkung nach der anaeroben Inkubation im Dunkeln einen schnellen Elektronenfluss auslöst, was sich in den hohen Geschwindigkeiten der H2-Entwicklung zeigt. Im Gegensatz dazu führen aufeinanderfolgende Belichtungen zu einer Verdreifachung der H2-Anreicherung, unabhängig von der Anzahl der Dunkel-Licht-Zyklen7. Der Mechanismus, der für diesen dramatischen Rückgang verantwortlich ist, ist bis heute unklar. In dieser Arbeit haben wir die Ursprünge dieses massiven Rückgangs anhand der Beurteilung globaler und lokaler Elektronenflüsse in intakten Algenkulturen und gereinigten PSII-Komplexen untersucht. Wir haben die Elektronentransportprozesse vom Sauerstoffentwicklungszentrum (OEC) im PSII zu Prozessen nach dem PSI aufgezeichnet und integriert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die redoxaktivierte „photosynthetische Kontrolle“, die für eine Verlangsamung der Cytb6f-Aktivität verantwortlich ist, Akzeptorbeschränkungen für PSII erzeugt, was seinen inneren Elektronenflussmechanismus verändert und eine massive Verringerung der effektiven Elektronenabgabe verursacht. Diese Herunterregulierung, die möglicherweise die Photoreduktion von O2 an der Akzeptorstelle von PSII und möglicherweise eine alternative Konformation der Restanordnung seiner Akzeptorstelle beinhaltet, führt später zu einer bemerkenswerten Verringerung der H2-Produktion.

Dunkle anoxische Kulturen grüner Mikroalgen geben bei Lichteinwirkung sofort H2 mit hoher Geschwindigkeit ab. Um seine Kinetik zu untersuchen, wurden C. reinhardtii-Zellen in mixotrophem Medium kultiviert und eine Stunde lang unter dunkler Anoxie inkubiert. Wie bereits beschrieben7, setzten wir die Zellen nach der Inkubation 2 Minuten lang Licht (370 µE m−² s−¹) aus und die Konzentrationen von freigesetztem H2 und O2 wurden mit einem Membraneinlass-Massenspektrometer (MIMS)16 überwacht (Abb . 1a, b). Wie erwartet sank die Geschwindigkeit der H2-Entwicklung nach einem anfänglichen Ausbruch schnell, bis sie vollständig zum Erliegen kam. Als die H2-Anreicherung ein Plateau erreichte, wurde das Licht ausgeschaltet. Wichtig ist, dass wir durch die Verfolgung der O2-Anreicherung die Zellen ausreichend lange im Dunkeln halten konnten, um O2 vollständig zu atmen (3–5 Minuten), und so die Anoxie aufrechtzuerhalten. Anschließend beleuchteten wir die Zellen erneut für 2 Minuten und beobachteten, dass die H2-Entwicklung wieder einsetzte. Diese Hell-Dunkel-Fluktuationen (Zyklen) wiederholten sich viermal, und obwohl bei allen aufeinanderfolgenden Lichtexpositionen H2 entwickelt wurde, beobachteten wir im Vergleich zur ersten Lichtexposition einen etwa dreifachen globalen Rückgang der H2-Akkumulationsraten (Abb. 1a – gestrichelt vs. durchgezogen). Interessanterweise beobachteten wir auch, dass die anfängliche Exposition einen sofortigen linearen Anstieg der Netto-O2-Entwicklung auslöste, im Gegensatz zu aufeinanderfolgenden Expositionen, bei denen ein exponentieller Anstieg zu beobachten ist (Abb. 1b – gestrichelt vs. durchgezogen). Um zu beurteilen, ob diese Unterschiede nur auf das mixotrophe Wachstum beschränkt sind, führten wir einen ähnlichen Test mit Zellen durch, die unter autotrophen Bedingungen kultiviert wurden (ergänzende Abbildung 1). Bemerkenswerterweise waren die H2-Produktionsraten in photoautotroph gezüchteten Kulturen niedriger, wie wir bereits berichteten7. Da diese Bedingungen höhere Geschwindigkeiten der O2-Entwicklung stimulieren, verstärkt das angesammelte O2 die kompetitive Hemmung der Hydrogenase-Aktivität (durch Reaktionen wie „Mehler-like“, Mehler und andere17). Daher haben wir diese Messungen in Gegenwart oder Abwesenheit von O2-Fängern (Glukoseoxidase [GOx], versorgt mit Glukose und Katalase) durchgeführt. Die Zugabe solcher Fänger erhöhte die Menge des angesammelten H2 leicht, von 10,7 ± 1,7 µM H2 in ihrer Abwesenheit auf 14,4 ± 1,3 µM H2 in ihrer Anwesenheit (ungefähr die Hälfte des unter mixotrophen adaptierten Zellen akkumulierten Wertes, 32,6 ± 2,5 µM H2). ). Darüber hinaus beobachteten wir, wie bei mixotrophen Bedingungen beobachtet, einen starken Rückgang der H2-Produktionsraten zwischen der ersten und den folgenden Lichtexpositionen (für beide Behandlungen), der bei Abwesenheit bei 50 ± 1 % und 65 ± 6 % Hemmung lag bzw. Vorhandensein von O2-Fängern.

Mixotrophe C. reinhardtii-Wildtyp-Kulturen (Stamm CC124) wurden eine Stunde lang unter dunkler Anaerobiose inkubiert und anschließend 2 Minuten lang Lichtschwankungen unter Beleuchtung ausgesetzt (bei einer Bestrahlungsstärke von 370 µmol Photonen m−² s−¹, weiß). Hintergrund), gefolgt von 3 Minuten Dunkelheit (grauer Hintergrund). Dargestellt sind die Unterschiede zwischen der anfänglichen Lichtbelichtung (gestrichelt) und dem Durchschnitt der aufeinanderfolgenden Belichtungen (durchgezogen). Die Konzentrationen von H2 (a) und O2 (b) wurden mit MIMS gemessen, und die Fluoreszenz von Chl a wurde gleichzeitig mit PAM (c) gemessen. Während der Beleuchtung wurden die Zellen Sättigungsimpulsen (markiert mit einem roten Pfeil) ausgesetzt, um die maximale Fluoreszenzintensität zu bestimmen. Das gleiche Protokoll wurde verwendet, um Änderungen der elektrochromen Verschiebungen (bei 520–546 nm) durch ein JTS (d) zu bewerten, bei dem die Zellen vor jeder Lichteinwirkung 30 s lang einem Laserblitz ausgesetzt wurden (siehe schwarze Pfeile in Tafel a). ). Die rechten Diagramme in jedem Panel zeigen einen Vergleich zwischen der anfänglichen (gestrichelten) und dem Durchschnitt aller drei aufeinanderfolgenden (durchgezogenen) Belichtungen im Verhältnis zu ihrem Zustand bei Lichtbeginn oder Laserblitz (Zeit, 0). Jede Kurve stellt das gemittelte Ergebnis von mindestens 3 biologischen Wiederholungen dar.

Netto-O2-Messungen reichen nicht aus, um die Wirksamkeit von PSII korrekt einzuschätzen, da sie nur die Bruttoproduktion auf einem bestimmten Niveau widerspiegeln können. Daher haben wir auch Veränderungen in der photosynthetischen Wirksamkeit getestet, indem wir die Fluoreszenz von Chlorophyll (Chl) gemessen haben (Abb. 1c). Die Kinetik der Chl a-Fluoreszenz nach dunkler Anoxie weist zwei Peaks20 auf. Der erste Peak wird unmittelbar nach der Lichteinwirkung erreicht, da alle QB-Stellen mit Plastoquinol21 besetzt sind. Der zweite Höhepunkt wird einige Sekunden später erreicht, weil: (i) die Aktivierung nachgelagerter Prozesse, insbesondere die CO2-Fixierung durch den CBB-Zyklus22, (ii) Konformationsänderungen im PSII19,23 oder (iii) die Verteilung von LHCII-Antennenkomplexen (Zustandsübergang)24. Nach diesen Spitzen erreicht das Fluoreszenzsignal einen stationären Zustand. Wie erwartet beobachteten wir, dass das Signal bei der ersten Belichtung 30 s lang anstieg (gestrichelt in Abb. 1c)25. Im Gegensatz dazu lösten aufeinanderfolgende Beleuchtungen einen sofortigen starken Anstieg im Zeitrahmen des ersten Peaks der Erstbelichtung aus und zeigten keinen weiteren Peak. Es ist jedoch zu beachten, dass nach 60 Sekunden Beleuchtung alle Fluoreszenzspuren ausgeglichen wurden und auf die gleiche Weise stetig abnahmen. Um zu beurteilen, ob sich die Wärmeableitung oder der Zustandsübergang veränderten, setzten wir die Zellen einem Sättigungsimpuls aus, als die Spuren den stationären Zustand erreichten (siehe rote Pfeile in Abb. 1c) und bestimmten die maximale Fluoreszenz (Fm‘). Wir haben keine signifikanten Veränderungen zwischen den Belichtungen beobachtet (ergänzende Abbildung 2), was auf minimale Veränderungen, wenn überhaupt, in der Größenordnung der nicht-photochemischen Löschung oder auf eine Abnahme der PSII-Effizienz aufgrund des Zustandsübergangs hinweist, wenn die Zellen den stationären Zustand erreichen. Um zu überprüfen, dass tatsächlich keine Verschiebungen in der Position der LHCII-Antennen stattgefunden haben, haben wir Zellen direkt aus der Küvette des Experiments entnommen und ihre Fluoreszenzspektren bei 77 ° K untersucht (ergänzende Abbildung 3). Wir haben beobachtet, dass die Peaks, die bei ~680 nm und ~710 nm beobachtet werden, keine Veränderungen zwischen dem ersten und den aufeinanderfolgenden Lichtimpulsen zeigen, was darauf hindeutet, dass die Zeit der Lichteinwirkung (2 Minuten) nicht ausreicht, um einen Zustandsübergang zu erzeugen26, in im Einklang mit früheren Untersuchungen9.

Um sicherzustellen, dass die Änderungen nicht auf Änderungen der Gesamteffizienz der Photosysteme zurückzuführen sind, untersuchten wir Unterschiede in den elektrochromen Verschiebungen (ECS) zwischen Lichtbelichtungen, indem wir Änderungen der Absorption bei 520 und 546 nm27 verfolgten (Abb. 1d, siehe auch; schwarz). Pfeile in Abb. 1a). Wenn Zellen einem einzelnen Laserblitz ausgesetzt werden, ändert sich ihre Absorption über eine 3-Phasen-Verschiebung27. Der anfängliche Anstieg des ECS-Signals (als „Phase a“ bezeichnet) dauert weniger als eine Millisekunde und ist ein Produkt der in beiden Photosystemen stattfindenden Ladungstrennungen. Daher kann ein verringertes Signal auf eine Abnahme von PSII und PSI-Aktivität hinweisen. Während der zweiten Phase (als „Phase b“ bezeichnet), die normalerweise bis zu 10 ms28 dauert, steigt das ECS-Signal aufgrund eines Aufbaus von Membranpotential, hauptsächlich über Cytb6f. In der letzten Phase (als „Phase c“ bezeichnet) nimmt das Signal exponentiell ab, da das Membranpotential durch die ATPase-Aktivität abgebaut wird. Hier beobachteten wir, dass alle Blitze, die vor jeder Belichtung abgegeben wurden (siehe schwarze Pfeile in Abb. 1a), eine identische Verschiebung auslösten, was darauf hindeutet, dass der Redoxzustand bei Lichtbeginn zwischen den Lichtschwankungen ähnlich war (Abb. 1d).

Es wurde zuvor gezeigt, dass die Aktivierung des zyklischen PSI-Elektronenflusses durch kontinuierliche Lichteinwirkung die Protonenantriebskraft durch die Thylakoidmembran erhöht, was die „Photosynthesekontrolle“29 einleitet und somit eine Verschiebung der geschwindigkeitsbestimmenden Schritte des Photosyntheseapparats verursacht . Die Steuerung der Photosynthese wird durch ein erhöhtes Redox-Gleichgewicht aktiviert, das von der Dauer der Bestrahlung abhängt. Es wurde vorgeschlagen, dass eine solche Regulierung den linearen Elektronenfluss3 und damit die H2-Produktion verringert30. Daher könnte man vermuten, dass solche Änderungen im Elektronenfluss ausreichend Zeit benötigen, damit sich die Redoxbalance über die Thylakoidmembran aufbaut. Um diese Hypothese zu testen, setzten wir die Kulturen nach einer Stunde Inkubation im Dunkeln für einen unterschiedlichen Zeitraum zwischen 5 und 180 s Licht aus (Abb. 2a). Anschließend wurden die Zellen 3 Minuten lang im Dunkeln gehalten, bevor sie ein zweites Mal für weitere 2 Minuten dem Licht ausgesetzt wurden. Zwei weitere Schwankungen (von 3 Minuten Dunkelheit/2 Minuten Beleuchtung, markiert als Belichtungen III und IV) wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass während des Experiments tatsächlich keine weiteren Änderungen auftreten. Anschließend verfolgten wir die Entwicklung von H2 (Abb. 2b) und die langsame Kinetik der Chl a-Fluoreszenz (Abb. 2c) während der zweiten 2-minütigen Beleuchtung (siehe Quadrat in Abb. 2a) und zeichneten die Ergebnisse entsprechend der vorangegangenen Dauer auf Erstbelichtung (d. h. Belichtung I). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung des photosynthetischen Regulierungsmechanismus während der ersten 30 s der Beleuchtung allmählich zunimmt (in Übereinstimmung mit unserer Beobachtung in Abb. 1b).

Zellen eines mixotrophen C. reinhardtii-Wildtypstamms CC124 wurden in einem MIMS auf H2-Entwicklung getestet. Die Zellen wurden eine Stunde lang unter dunkler Anaerobiose inkubiert und anschließend für eine Dauer von 5, 10, 20, 30, 45, 60, 120 oder 180 s beleuchtet (370 µE m−² s−¹) (Belichtung). Ich, siehe verschraubte Zeitskala). Hier ist die Spur dargestellt, die durch 45-sekündige Belichtung der Zellen in Belichtung I gemessen wurde. Nach der ersten Belichtung wurden die Zellen 3 Minuten lang im Dunkeln gehalten (grauer Hintergrund) und erneut 2 Minuten lang beleuchtet. dreimal (Aufnahmen II, III und IV, weißer Hintergrund). Um die Auswirkungen der Expositionsdauer I auf die Photosyntheseregulation zu vergleichen, wurden die während der Exposition II gemessenen Ergebnisse gegen die akkumulierte H2-Konzentration (b) und die Photosyntheseeffizienz aufgetragen, die durch Chl a-Fluoreszenzmessungen (c) bewertet wurde. Elektrochrome Verschiebungen wurden durch Messung der Absorptionsänderungen der Zellen (520–546 nm) bestimmt. Drei Sekunden nach der Belichtung I (siehe gestrichelter Pfeil in Bild a) wurden die Zellen einem 5-ns-Laserblitz ausgesetzt und die Ladungstrennung wurde gemessen (d). Der Farbindex in allen Panels entspricht der Belichtungsdauer I (in Sekunden): 5 – Lila, 10 – Blau, 20 – Cyan, 30 – Grün, 45 – Hellgrün, 60 – Gelb, 120 – Rot und 180 – Dunkel Rot. Jedes Experiment wurde mit mindestens drei biologischen Replikaten wiederholt. Fehlerbalken geben den Standardfehler an (n ≥ 3).

Um die Aktivierung der „photosynthetischen Kontrolle“ besser zu verstehen, haben wir den damit verbundenen Aufbau des Redox-Gleichgewichts überwacht. Wir haben die Zellen 3 s nach der ersten Lichteinwirkung einem kurzen Laserblitz ausgesetzt (siehe schwarzer Pfeil in Abb. 2a) und Änderungen in der Kinetik des ECS-Aufbaus gemessen (Abb. 2d). Wir beobachteten, dass, obwohl keine Unterschiede in der schnellen Ladungstrennung bei „Phase a“ erkennbar sind (ergänzende Abbildung 4), der Aufbau des Redoxpotentials, erkennbar am Fehlen eines offensichtlichen Anstiegs der Spur bei „Phase b“, erfolgt allmählich, was mit der Abnahme der H2-Produktion übereinstimmt. Solche Änderungen des Redoxpotentials sollten aufgrund der Aktivierung der „photosynthetischen Kontrolle“ auch den Elektronenfluss über Cytb6f verringern und daher allmählich eine Einschränkung auf der Donorseite des PSI und eine Einschränkung auf der Akzeptorseite des PSII darstellen. Eine solche Einschränkung könnte letztendlich zu einer verringerten Geschwindigkeit des linearen Elektronenflusses führen, was sich auch in einer geringeren Geschwindigkeit der H2-Produktion niederschlägt. Es ist natürlich möglich, dass eine verstärkte Aktivität der ATPase, die als beschleunigter Rückgang in „Phase c“ beobachtet wird, den Aufbau der Membranladung verringert und daher die in „Phase b“ beobachtete Amplitude verringert31. Dies sollte jedoch erneut auf eine schnelle Bildung von Redox-Gleichgewicht hinweisen, da es für die Induktion einer solchen beschleunigten Aktivität der ATPase erforderlich ist, und sollte daher auch zur Erzeugung einer „photosynthetischen Kontrolle“ führen, die zu Akzeptorbeschränkungen für PSII führen würde. Diese Ergebnisse stimmen mit der Annahme überein, dass unter Anoxie die gebildete Redoxbalance die Geschwindigkeit des linearen Elektronenflusses verringert. Dennoch schlagen wir hier vor, dass diese Merkmale zu einer schwerwiegenderen Einschränkung führen, die innerhalb des PSII liegt, und zwar durch eine Veränderung seines Wirkmechanismus.

Um die Ursache für die offensichtliche Abnahme des linearen Elektronenflusses zu ermitteln, haben wir die Auswirkung von Anoxie auf die Aktivität isolierter PSII untersucht. Zu diesem Zweck haben wir PSII-Komplexe aus Zellen des C. reinhardtii-Wildtypstamms CC124 gereinigt und die O2-Entwicklungsraten mithilfe einer Pyroscience FireSting O2-Sonde32 untersucht (Abb. 3a). Wir haben gereinigte PSII-Komplexe in Gegenwart von 2,5-Dichlor-p-benzochinon (DCBQ) aktinischem Licht ausgesetzt, damit sie an der QB-Stelle keinen akzeptorseitigen Einschränkungen unterliegen. Die Komplexe wurden 10 Sekunden lang einer Beleuchtung ausgesetzt, bei der die O2-Entwicklungsraten bestimmt wurden, bevor das Licht für eine Minute ausgeschaltet wurde. Dann belichteten wir sie weitere 10 Sekunden lang und bestimmten die Restaktivität der zweiten Belichtung im Verhältnis zur ersten. Da wir die Auswirkungen von Anoxie auf die Aktivität von PSII untersuchten, führten wir das Experiment entweder unter aeroben oder anoxischen Bedingungen durch, die durch Spülen der Proben mit N2 hergestellt wurden (Abb. 3a, jeweils aerob vs. anoxisch). Um die Auswirkungen von Bikarbonat (das in Form von NaHCO3 zugesetzt wurde, siehe „Methoden“) zu beurteilen, führten wir außerdem das gleiche Experiment in dessen Anwesenheit oder völliger Abwesenheit durch. Die Ergebnisse zeigen, dass die dunklen, anoxischen Bedingungen die PSII-Aktivität bei anfänglicher Lichtexposition deutlich um bis zu 70 % verringern, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt33. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die anfängliche Lichtexposition nicht durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von NaHCO3 beeinflusst wurde (weder unter aeroben noch unter anoxischen Bedingungen). Es ist zu beachten, dass das Einblasen von N2 die Bicarbonatkonzentration von 10 mM auf 7,5 mM senkte, gemessen durch MIMS (ergänzende Abbildung 5). Interessanterweise beobachteten wir, dass bei der zweiten Beleuchtung die O2-Entwicklungsraten unter aeroben Bedingungen nicht beeinflusst wurden, weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von NaHCO3. Allerdings führten anoxische Bedingungen bei der zweiten Beleuchtung zu einer verringerten Aktivität von ~45 % (mit einer Signifikanz von pv = 0,0154 im t-Test eines Schülers), nur in Gegenwart von NaHCO3.

PSII-Komplexe wurden aus Zellen des C. reinhardtii-Wildtypstamms CC124 isoliert und ihre Aktivität wurde mit einer Pyroscience FireSting O2-Sonde getestet (a). Die Komplexe wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 mM (tatsächlich 7,5 mM) NaHCO3 getestet, um Bedingungen mit hohem Kohlenstoffgehalt nachzuahmen, und entweder unter aeroben oder anoxischen Bedingungen untersucht. Die Komplexe wurden zweimal 10 s lang dem Licht ausgesetzt, mit einer Dunkelperiode von einer Minute dazwischen. Dargestellt sind die Raten der ersten (blau) und zweiten (weißen) Belichtung für jeden Satz von Bedingungen. Außerdem werden die Restaktivitätsraten zwischen den einzelnen ausgerichteten Expositionen angegeben (entsprechend der gemittelten Rate). Komplexe in Gegenwart von NaHCO3 wurden auch während längerer Beleuchtungsperioden von 5, 10, 20 oder 30 s (lila, blau, cyan bzw. grün) unter entweder aeroben (gestreiften) oder anoxischen (festen) Bedingungen getestet das Vorhandensein von 10 mM (tatsächlich 7,5 mM) NaHCO3 (b). Dargestellt ist die Restmenge an O2, die sich bei der zweiten Belichtung im Vergleich zur ersten Belichtung angesammelt hat. Die folgende Tabelle zeigt die Raten der ersten und zweiten Exposition für jede Behandlung (µmol O2 mg Chl−1 h−1) sowie die Anzahl der Wiederholungen für jedes Ergebnis. Darüber hinaus wurde der Unterschied zwischen der aeroben und der anoxischen Behandlung mithilfe eines Student-T-Tests analysiert. Für jedes Paar werden P-Werte angegeben. Jedes Experiment wurde mit mindestens drei biologischen Replikaten wiederholt. Die Daten werden in Boxplots dargestellt.

In unseren In-vivo-Untersuchungen haben wir beobachtet, dass die Hemmung der scheinbaren PSII-Aktivität bei längerer Lichteinwirkung zunimmt (Abb. 2). Um diese Effekte an isolierten PSII-Komplexen zu testen, haben wir sie für eine Dauer von 5, 10, 20 oder 30 s beleuchtet (Abb. 3b, Lila, Blau, Cyan bzw. Grün, Färbung stimmt mit anderen Panels überein). Wie zuvor wurden die Komplexe zwei Belichtungen ausgesetzt, die Geschwindigkeit der O2-Entwicklung wurde für jede Belichtung bestimmt und das Restaktivitätsverhältnis wurde für jede Belichtungsdauer berechnet. Bemerkenswerterweise wurde unter aeroben Bedingungen während der gesamten Exposition kein Rückgang der PSII-Aktivität beobachtet und die Aktivität blieb bei etwa 85 % (Abb. 3b, gestreifte Säulen). Im Gegensatz dazu zeigten Komplexe, die unter Anoxie in Gegenwart von Bicarbonat Licht ausgesetzt wurden, eine allmähliche Abnahme ihrer Aktivität bei längerer Expositionsdauer und es wurde festgestellt, dass sie während der 30-sekündigen Beleuchtung 63 % weniger O2 entwickelten, was in ist im Einklang mit unseren In-vivo-Beobachtungen.

Da wir beobachteten, dass Lichteinwirkung eine Abnahme des linearen Elektronenflusses auslöste, untersuchten wir, ob solche Modulationen dauerhaft sind oder durch längere anoxische Dunkelheit umgekehrt werden könnten. Zu diesem Zweck haben wir die Dauer der Dunkelheit zwischen den Lichtbelichtungen schrittweise erhöht, die auf eine konstante Beleuchtungsdauer von 2 Minuten eingestellt waren (Abb. 4a). Die Dunkelerholungsperioden wurden auf 3, 5, 7, 10 und 15 Minuten festgelegt, wobei es vor der letzten Beleuchtung weitere 3 Minuten Dunkelheit gab, um zu überprüfen, ob die beobachteten Veränderungen tatsächlich auf die Dauer der Dunkelheit und nicht auf die Gesamtzeit zurückzuführen sind im Experiment bestanden (markiert mit einem Sternchen; 3*). Um mögliche Störungen durch angesammeltes O2 zu beseitigen, haben wir außerdem einen O2-Fänger, Glucoseoxidase (GOx, versorgt mit Glucose und Katalase34), hinzugefügt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Abnahme der H2-Entwicklung nach 3 Minuten Dunkelheit nicht durch die Abwesenheit von O2 beeinflusst wird (Abb. 4b) und dass die H2-Entwicklungsrate als Funktion der Dunkelerholungszeit zunimmt. Wir haben auch beobachtet, dass die Zellen mindestens 15 Minuten Dunkelheit benötigen, um die anfängliche H2-Entwicklungsrate wieder vollständig zu erreichen. Da wir zuvor Veränderungen in der PSII-Aktivität beobachtet hatten (Abb. 1c), verfolgten wir gleichzeitig mit MIMS-Messungen Veränderungen in der Chl a-Fluoreszenz (Abb. 4c). Hier beobachteten wir die gleichen allmählichen Veränderungen im frühen Fluoreszenzanstieg von ~60 s, was darauf hindeutet, dass die Aktivität von PSII tatsächlich in der Dunkelperiode von 15 Minuten wiederhergestellt wurde. Um zu überprüfen, dass der Zustandsübergang die Fluoreszenzintensität nicht verringert, setzten wir die Zellen 60 s vor und 30 s nach jeder Beleuchtungsperiode einem Sättigungsimpuls aus und beobachteten keine Unterschiede zwischen gepaarten maximalen Fluoreszenzwerten (ergänzende Abbildung 6). Wir könnten daher den Schluss ziehen, dass die potenzielle Aktivität von PSII aufgrund von Lichtschäden oder Zustandsübergängen nicht verringert wird.

Nach einer Stunde Inkubation im Dunkeln in Gegenwart von O2-Fängern (GOx) wurden Zellen des C. reinhardtii-Wildtyp-Stamms CC124 einer Reihe von Lichtexpositionen mit fester Dauer ausgesetzt (370 µE m−2 s−1 für 2 Minuten, weiß). Hintergrund) schlüpfte mit zunehmender Dauer der anoxischen Dunkelinkubationen von 0–15 Minuten. eine H2-Anreicherung als Funktion der vorangegangenen dunklen Inkubationszeit (grauer Hintergrund) zwischen festgelegten 2 Minuten Bestrahlungsstärke. Die Produktion von H2 bei jeder Lichtexposition wurde durch MIMS gemessen und die Spur wird entsprechend der vorangegangenen Dauer der Dunkelinkubation hervorgehoben (erste Exposition, 0 – gestrichelt, 3 Min. – lila, 5 Min. – blau, 7 Min. – grün, 10 Min – Gelb, 15 Min. – Rot, weitere 3 Min. – gepunktetes Rosa, für alle Spuren in allen Panels wurde der gleiche Farbindex verwendet. b Um den Vergleich zwischen den in Tafel a gezeigten Unterschieden in den H2-Anreicherungsspuren zu erleichtern, werden alle bei jeder Lichtperiode gemessenen Spuren auf einmal in einem einzigen festen Zeitrahmen aufgezeichnet. c Um die Veränderungen der PSII-Photosyntheseeffizienz zu beurteilen, wurde gleichzeitig die Chl a-Fluoreszenz gemessen. Bei jeder Beleuchtung wurden die Zellen einem Sättigungspuls ausgesetzt und die maximale Fluoreszenz (Fm') wurde bestimmt. Die Photosyntheseeffizienz wurde dann auf Fm' normalisiert. d Die Thermolumineszenz intakter Algenzellen wurde nach 2 einzelnen Turnover-Blitzen (STF) im Abstand von 1 s gemessen. Die Proben wurden nach einer Stunde anaerober Inkubation im Dunkeln (grau) gemessen. Dann wurden sie 2 Minuten lang beleuchtet, gefolgt von einer Dunkelentspannung von entweder 5 (blau) oder 15 (rot) Minuten und der Temperatur, bei der die Maximalwerte für das B-Band ermittelt wurden. Die gewonnenen Werte wurden in Boxplots dargestellt. Jedes Experiment wurde mit mindestens drei biologischen Replikaten wiederholt.

Anschließend untersuchten wir Veränderungen im Elektronentransport innerhalb des PSII, indem wir die Auswirkung der Lichtexposition auf intakte Zellen mittels Thermolumineszenz (TL) beurteilten. Die Lichtemission einer vorbeleuchteten Probe während des Temperaturanstiegs liefert wertvolle Informationen über die Ladungsrekombinationsreaktionen, die im PSII stattfinden (Übersichten zu diesem Thema finden Sie in Lit. 35, 36). Wenn intakte Zellen oder Blätter zwei einzelnen Umsatzblitzen ausgesetzt werden, erscheint die „B-Bande“ mit einem Maximum bei etwa 20 bis 40 °C, die aus einer gemischten Rekombination von QB- mit den S2- und S3-Zuständen des OEC35 stammt. Wir haben intakte Zellen nach einer Stunde dunkler anoxischer Inkubation gemessen und die maximale B-Band-Intensität bei 18,1 ± 1,5 °C beobachtet (Abb. 4d, Rohspuren und die Auswirkungen zusätzlicher Blitze auf das B-Band sind in (ergänzende Abbildung 7) dargestellt )). Anschließend setzten wir die Zellen 2 Minuten lang Licht aus, gefolgt von 5 Minuten Dunkelheit, und führten nach zwei Blitzen eine TL-Messung durch. Für eine vollständige Wiederherstellung des B-Bandes reichen in der Regel einige Minuten Dunkeladaption aus; In den anoxischen Kulturen, die 2 Minuten lang beleuchtet wurden, wurde jedoch eine starke Abnahme der Intensität der B-Bande beobachtet, was darauf hindeutet, dass zwischen den S2- und S3-Zuständen des OEC und QB- eine geringere Ladungsrekombination auftrat oder alternativ die Rekombination über nicht-strahlende Strahlung erfolgte Wege37,38. Darüber hinaus wurde die Spitzenposition der maximalen TL-Intensität deutlich nach unten verschoben, auf 12,3 ± 1,0 °C (mit einem p-Wert von 0,005 im t-Test eines Schülers). Diese Veränderungen deuten darauf hin, dass sich das Redoxgleichgewicht zwischen QA- und QB- in Richtung QA- verändert hat, was die Ladungsrekombination zwischen QA- und der Donorseite erleichtert. Um festzustellen, ob sich diese Verschiebungen während längerer Perioden anoxischer Dunkelheit tatsächlich umkehren, setzten wir die Zellen einer zweiten 2-minütigen Beleuchtungsperiode aus, gefolgt von 15 Minuten anoxischer Dunkelheit. Wir beobachteten, dass sich sowohl die Intensität als auch die Peakposition der B-Bande (18,4 ± 1,7 °C) nach 15 Minuten dunkler Anoxie weitgehend erholten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ladungsrekombinationsreaktionen innerhalb des PSII durch Lichteinwirkung auf reversible Weise verändert werden. Die Daten deuten auch darauf hin, dass die Ursache für den scheinbaren Rückgang der Leistung des gesamten Elektronenflusses unter Anaerobiose auf Veränderungen im PSII zurückzuführen ist.

In der Natur sind Grünalgen verschiedenen Umweltveränderungen ausgesetzt. Da sie größtenteils auf dem Betrieb des Photosyntheseapparats beruhen, werden viele dieser Veränderungen durch die Fähigkeit der Zellen gelöst, den Verlauf ihres metabolischen Elektronenflusses schnell zu ändern39,40. Tatsächlich war die Aktivierung oder Deaktivierung von Elektronensenken in letzter Zeit Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten und es wurde gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle für die Fähigkeit der Zellen spielt, ihre Funktionalität aufrechtzuerhalten5,7,8,15. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Grünalgen unter Anoxie über zusätzliche Regulationsmechanismen verfügen, die einen tiefgreifenden Einfluss auf die Gesamtproduktivität des Photosyntheseapparats haben und dessen Elektronenausstoß verringern (Abb. 1). Dieser Mechanismus wird innerhalb von 10 s nach der Beleuchtung aktiviert und führt zu einer massiven Verlangsamung des Elektronenflusses um das Dreifache (Abb. 2). Dieser Mechanismus ist reversibel und kann nach einer 15-minütigen dunklen anoxischen Inkubation ausgeschaltet werden (wodurch der schnelle Elektronenfluss wiederhergestellt wird) (Abb. 4).

Nach der anaeroben Induktion erzeugen alternative Elektronenflusswege zusammen mit einer erhöhten ATPase-Aktivität ein zusätzliches Redoxpotential und eine zusätzliche ATP-Versorgung, die CO2-Fixierung beginnt und es kommt zu einem allgemeinen Anstieg des Elektronenflusses7,14,31. Es wurde zuvor gezeigt, dass die erhöhte Protonenantriebskraft die „photosynthetische Kontrolle“ aktiviert, bei der die Geschwindigkeit des Elektronenflusses durch Cytb6f verringert wird3. Eine solche Abnahme führt zu einem kontinuierlich verringerten PQ-Pool und behindert die Aktivität von PSII, wodurch ein übermäßiger Druck auf seiner Akzeptorseite entsteht. Diese Situation liefert die Grundlage für die von Cardona et al. aufgestellte Hypothese, die besagt: „Ein Wechsel auf der Akzeptorseite, falls er existiert, könnte beispielsweise durch die Bildung von QA- ausgelöst werden, bevor QBH2 die Stelle verlassen hat, oder durch die Bildung von QB- bevor QH2 den Kanal verlassen hat und in der Nähe des Häms verbleibt“41.

Während der aeroben Lichteinwirkung verringerte die Aktivierung der nicht-photochemischen Löschung nachweislich die Ausbeute der PSII-Lichtgewinnung42,43,44,45 und verringerte so den durch überschüssiges Licht verursachten Druck. In dieser Arbeit, die sich auf Anoxie konzentriert, haben wir auch Veränderungen in der Chl a-Fluoreszenz beobachtet (Abb. 2c), die fälschlicherweise als Veränderungen im NPQ interpretiert werden können. Es wurde jedoch gezeigt, dass weder die energieabhängige qE-Komponente von NPQ, die innerhalb von weniger als einer Minute entspannt werden sollte, noch der Zustandsübergang unkorreliert ist (ergänzende Abbildung 3). Darüber hinaus entstehen die Fluoreszenzunterschiede nicht durch Photoinhibition, da die Sättigungspulse und die ECS-Messungen keine Unterschiede zwischen Lichtschwankungen zeigten (siehe Abb. 1c, d und ergänzende Abbildungen 4, 6). Tatsächlich haben wir beobachtet, dass die Einschränkungen auf der Akzeptorseite bei Dunkelheit in einem Zeitrahmen von weniger als 3 Minuten aufgehoben werden, wie durch ECS-Messungen belegt (Abb. 1d). Schließlich zeigen die TL-Daten (Abb. 4d) den Ursprung dieses anoxischen Verlangsamungsmechanismus für PSII. Wir können daher den Schluss ziehen, dass die erzeugten Akzeptorbeschränkungen intrinsische Veränderungen im PSII mit sich bringen und dessen Elektronenausstoß verringern. Diese verringerte Leistung führt zu einer offensichtlichen Verringerung des linearen Elektronenflusses, was sich in einer verringerten H2-Produktionsrate durch die Zellen zeigt.

Die verbleibende Frage im Folgenden ist: Welcher Mechanismus steht hinter dieser offensichtlich verringerten Elektronenabgabe durch PSII? Kürzlich wurde gezeigt, dass der Anregungsdruck, der durch einen zu stark reduzierten PQ-Pool verursacht wird, zu einer zu starken Reduzierung von QA und QB des PSII führt. Die erhöhte Bildung von QA- verändert die Dissoziationskonstante des HCO3--Moleküls und kann zu dessen Freisetzung führen46. Später begünstigt die unbesetzte Stelle eine alternative Anlagerung eines O2-Moleküls47. Zu diesem Zeitpunkt kann ein erneut reduziertes Semichinol bei QA- das Elektron nicht vollständig auf QB übertragen, da das Nicht-Häm-Eisenmolekül an O2 gebunden ist. Es ist daher wahrscheinlich, dass dieses O2-Molekül durch QA- reduziert wird und das oxidative Radikal O2●¯47,48 freisetzt, das später in Peroxid umgewandelt werden könnte. Dieser Prozess wird zweifellos die scheinbare Elektronenabgabe von PSII verringern, wie hier beobachtet werden kann (Abb. 1c, 2c und 4c). Diese Beobachtung deckt sich mit der beobachteten verminderten Aktivität der gereinigten Komplexe unter anoxischen Bedingungen in Gegenwart eines Überschusses an oxidiertem Chinon (DCBQ) (Abb. 3). Wir beobachteten jedoch auch eine zusätzliche Verlangsamung der PSII-Aktivität unter Anoxie, die in Gegenwart eines Überschusses an Bikarbonat stattfand (Abb. 3). Darüber hinaus sollte man bedenken, dass die In-vivo-Beobachtungen (Abb. 4) zeigen, dass das Ausschalten dieser Verlangsamung und das Zurückgewinnen der ursprünglichen dreifach höheren PSII-Rate eine minimale Inkubation von 15 Minuten in dunkler Anoxie erfordert – ziemlich lange für eine direkte Bindung eines Liganden an sein Ziel. Daher scheint es, dass Modulationen der Affinitäten von Nicht-Häm-Eisen zu Bicarbonat zwar die Geschwindigkeit des scheinbaren linearen Elektronenflusses verringern, aber auch zusätzliche Veränderungen auslösen, die eine längere Wirkung haben könnten.

Eine Hypothese beinhaltet eine Konformationsänderung, bei der das HCO3-Molekül durch einen Glutamatrest von PsbD (E241-D2) ersetzt wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine solche Struktur in unreifen Cyanobakterien PSII49 existiert. Dies war möglich durch die Anbindung einer weiteren Untereinheit namens Psb28 (die einige funktionelle Ähnlichkeiten mit der pflanzlichen PsbW-Untereinheit50 aufweist), die eine starke Bindung an eine Schleife auf PsbA bildet. Eine solche Verzerrung verschiebt den E241-D2-Rest in Richtung des Nicht-Häm-Eisens und stabilisiert den Komplex. Es wurde auch postuliert, dass eine solche Konformation den Aufbauprozess von PSII unterstützen könnte, indem sie den Restelektronentransfer ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, dass die Position von E241-D2 neben dem Nicht-Häm-Eisen strukturell derjenigen von E234-M im anoxygenen bakteriellen Reaktionszentrum ähnelt51 (für einen weiteren Vergleich siehe Lit. 41,52, 53). Wir könnten dann postulieren, dass solche Veränderungen unter Anoxie möglich sind und hinter der veränderten Aktivitätsrate stehen könnten. Dies könnte auch erklären, warum die Entspannung der Komplexe zurück zu ihrer optimalen Aktivität eine lange Zeitspanne benötigt. Bisher wurde eine solche Konformation jedoch in isolierten PSII-Komplexen nicht nachgewiesen, sodass wir nur über ihre Existenz und mögliche Funktion spekulieren konnten.

Alternativ kann man, sobald die photosynthetische Elektronentransportkette überreduziert ist und eine Entkopplung zwischen der PSII-Elektronenabgabe und der O2-Entwicklung hergestellt ist54, vermuten, dass es sich bei dem Verlangsamungsmechanismus nicht um eine direkte Rückreaktion der Strahlungsladung handelt, sondern vielmehr um die Entstehung eines zyklischen Elektronenflusses in PSII vermutlich über Cytb559. Dementsprechend führt das reduzierte Häm am Cytb559 die Elektronen wieder in das Chlorophyllpaar von P680 in Richtung der QA-Stelle ein, und zwar auf eine Weise, die vom potentiellen Zustand des Häms55 abhängt. Tatsächlich wurde postuliert, dass Cytb559 in der Lage ist, Plastoquinol von der QB-Stelle zu oxidieren und so die Einschränkungen des PSII-Akzeptors zu mildern. Der Mechanismus eines solchen Weges ist jedoch noch unklar und erfordert in Zukunft weitere Untersuchungen. In jedem Fall wird der zusätzliche Elektronendruck durch einen alternativen lokalen Elektronenakzeptor gemildert, bei dem es sich möglicherweise um O2 in der Nähe des PSII handeln könnte.

Abschließend beschreiben wir hier einen unerwarteten Mechanismus, der die PSII-Elektronenabgabe unter Anoxie verringert. Dieser Prozess kann die Übererregung des Photosyntheseapparats verhindern und so oxidative Schäden abmildern. Um seine mechanistischen Details aufzudecken, sind natürlich zusätzliche experimentelle Beweise und theoretische Überlegungen erforderlich. Doch leider verringert diese Abnahme des scheinbaren linearen Elektronenflusses auch die Elektronenleistung des gesamten Photosyntheseapparats, was neue Hindernisse bei der Suche nach photosynthesebasierten erneuerbaren Energiequellen mit sich bringt. Derzeit ist dieser Mechanismus die gläserne Decke, die die Ausbeute der photosynthetischen H2-Produktion auf nur ein Drittel ihres Potenzials verringert.

Der Chlamydomonas reinhardtii-Stamm CC124 (137 c mt-) wurde vom Chlamydomonas Resource Center bezogen. Zellkulturen wurden in Erlenmeyerkolben unter kontinuierlicher Beleuchtung (bei einer Bestrahlungsstärke von 60 μE m−2 s−1) in TAP-Medium (oder TP für autotrophe Kulturen) gehalten und kultiviert. Zellproben wurden aus Kulturen in der frühen Log-Phase entnommen (zwischen 2–5 mg Chl mL−1). Die Chlorophyllkonzentration wurde mit 90 % Aceton nach Ritchie58 bestimmt.

Die Zellen wurden auf eine Endkonzentration von 20 mg Chl-ml-1 in TAP (oder TP für autotrophe Kulturen), 50 mM HEPES, pH 7,2, zentrifugiert und in eine versiegelte Quarzküvette (5 ml) gegeben. Bei Bedarf wurden Glucoseoxidase (200 Einheiten ml–1), Katalase (200 Einheiten ml–1) und Glucose (50 mM) zugegeben, um Spuren von O2 abzufangen. Die anaerobe Induktion wurde erreicht, indem die Zellen eine Stunde lang im Dunkeln gehalten wurden. Falls angegeben, wurden 40 µM (Endkonzentration) 3-(3,4-Dichlorphenyl)-1,1-Dimethylharnstoff (DCMU, Sigma-Aldrich) und 1 mM (Endkonzentration) Hydroxylamin (HA, Sigma-Aldrich) hinzugefügt 10 Minuten vor der Messung. In allen im JTS durchgeführten Experimenten wurden vor der Induktion 10 % Ficoll zugesetzt, um eine Zellsedimentation zu vermeiden.

Um die Konzentration diffundierter Gase wie H2 und O2 zu verfolgen, wurde die Versuchsküvette in ein selbstgebautes Membraneinlass-Massenspektrometer (MIMS) gestellt, wie in Lit. beschrieben. 16. Gleichzeitig wurden Chl a-Fluoreszenzmessungen mit einem DUAL-PAM-100 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Deutschland) durchgeführt. Zur Überwachung des Zustandsübergangs wurden Zellproben direkt aus der Versuchsküvette (50 μl) entnommen, in eine Glaskapillare injiziert und in einen mit flüssigem Stickstoff (bei 77 °K) gefüllten Glas-Dewar (Horiba) eingesetzt. Die Proben wurden dann in einem Fluorimeter (Horiba Fluoromax-4) mit einem Anregungslicht von 435 nm gemessen. Die Emission wurde zwischen 650 und 750 nm gemessen.

Elektrochrome Verschiebungen (ECS) wurden mit einem Joliot-Typ-Spektrometer (JTS-100, Biologic SAS, Frankreich) nachgewiesen, das mit einer BiLED ausgestattet ist und gleichzeitig die Absorption von 520 und 546 nm messen kann, wie in Lit. beschrieben. 59. Bei Bedarf wurden Laserblitze mit einem frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser (Litron Nano) gepumpt, die Anregungswellenlänge wurde mit einem Farbstoff (DCM, Exciton Laser Dye) angepasst. Wenn Zellen einem einzelnen Laserblitz ausgesetzt werden, ändert sich ihre Absorption über eine 3-Phasen-Verschiebung27. Der anfängliche Anstieg des ECS-Signals (als „Phase a“ bezeichnet) dauert weniger als eine Millisekunde und ist ein Produkt der in beiden Photosystemen stattfindenden Ladungstrennungen. Daher kann ein verringertes Signal auf deren Abbau hinweisen. Während der zweiten Phase (als „Phase b“ bezeichnet), die normalerweise bis zu 10 ms28 dauert, steigt das ECS-Signal aufgrund des Aufbaus von Membranpotential, hauptsächlich über Cytb6f. In der letzten Phase (als „Phase c“ bezeichnet) nimmt das Signal exponentiell ab, da das Membranpotential über die ATPase-Aktivität abgebaut wird. Da keine Unterschiede in der Amplitude von „Phase a“ beobachtet wurden (Ergänzende Abbildung 3), wurden die Ergebnisse normalisiert. Beobachtete Unterschiede in der Kinetik sowohl der scheinbaren „Phase b“ als auch der „Phase c“ wurden verwendet, um Verschiebungen im Redoxpotential über die Thylakoidmembran zu bestimmen.

Die Zellen wurden kurz zentrifugiert und in einer Endkonzentration von 15 mg Chl mL−1 auf ein Minimalmedium (TP) übertragen. Anaerobe Kulturen wurden in 13-ml-Hypovialflaschen gegeben und 10 Minuten lang im Dunkeln mit N2 gespült, gefolgt von einer weiteren Stunde Inkubation im Dunkeln unter kontinuierlichem Schütteln. Beleuchtete Kulturen wurden 2 Minuten lang Licht ausgesetzt (bei einer Bestrahlungsstärke von 370 μE m−2 s−1), gefolgt von entweder 5 oder 15 Minuten Dunkelheit, bevor Proben entnommen wurden (300 µL). TL-Messungen wurden mit einem speziell angefertigten TL-Gerät durchgeführt, wie in Lit. beschrieben. 60. Für die Messungen wurden die Proben auf einer Kupferplatte an der Luft platziert und mit einem in flüssigem N2 getauchten Kühlfinger verbunden. Eine Heizspirale (SEI 10/50, Thermocoax, Frankreich) sorgte während der Messung für die gewünschte Temperatur der Probe. Es ist zu beachten, dass im Fall ganzer Zellen das Einfrieren vor TL-Messungen wegen möglicher Zellschäden nicht empfohlen wird35, daher wurden Algenproben bei 4 °C durch zwei einzelne sättigende Xe-Blitze (mit einer Dauer von 1,5 μs bei halber Temperatur) angeregt. Spitzenintensität mit einer Verzögerung von 1 Sekunde zwischen den Blitzen). Anschließend wurde die Probe im Dunkeln mit einer Heizrate von 20 °C min−1 auf 70 °C erhitzt. Der emittierte TL wurde mit einem Photomultiplier (H10721-20, Hamamatsu, Japan) gleichzeitig mit der Temperaturaufzeichnung gemessen.

Chlamydomonas reinhardtii-Zellen wurden in einem 10 l TAP-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden unter ständigem Rühren und Einblasen von Luft unter kontinuierlichem weißem Licht (35–40 µE m−² s−¹) bei 18 °C kultiviert, bis die endgültige OD730 0,5–0,7 erreichte. Anschließend wurde die Kultur auf O2-Entwicklung überprüft, durch 5-minütige Zentrifugation bei 3500 × g geerntet und in einem Medium resuspendiert, das 25 mM HEPES pH 7,5, 300 mM Saccharose und 5 mM MgCl2 enthielt. Die Zellen wurden einmal im gleichen Puffer gewaschen, 5 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert und in einem Hauptpuffer resuspendiert, der 25 mM MES-NaOH, pH 6,5, 1 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1 M Betain, 200 mM Saccharose enthielt. und 10 % des Glycerins. Der Protease-Inhibitoren-Cocktail wurde zu Endkonzentrationen von 1 mM PMSF, 1 μM Pepstatin, 60 μM Bestatin und 1 mM Benzamidin hinzugefügt. Die Zellen wurden mit einem Avestin EmulsiFlex-C3 bei 2000 psi (zwei Zyklen) aufgeschlossen. Unzerbrochene Zellen und Stärkekörnchen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g entfernt und die Membranen im Überstand wurden durch 40-minütige Zentrifugation in einem Ti70-Rotor bei 273.300 × g ausgefällt. Das Pellet wurde im gleichen Aufbrechpuffer resuspendiert, was eine Chlorophyllkonzentration von 2 mg Chl mL−1 ergab. n-Decyl-α-D-Maltopyranosid (α-DM) und n-Octyl-β-D-glucopyranosid wurden tropfenweise bis zu einer Endkonzentration von jeweils 2,5 % und einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von 1 mg Chl mL−1 zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei 4 °C wurde das unlösliche Material durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g entfernt. Der Überstand wurde auf Saccharosegradienten im SW-60-Rotor geladen (≈900 μg Chlorophyll pro Röhrchen), Gradientenzusammensetzung 15–40 % Saccharose, 25 mM MES-NaOH, pH 6,0, 0,5 M Betain, 10 % Glycerin, 0,2 % α- DM und 14–16 Stunden lang bei 310.000 × g laufen lassen. Die beiden unteren Banden wurden gesammelt und direkt gemessen (ein Einfrieren ist nicht möglich, da sich die Probenqualität schnell verschlechtert), wie unten beschrieben.

Zur Bestimmung der O2-Entwicklung wurde gereinigtes PSII mit einer Endkonzentration von 10 µg Chl mL−1 in 25 mM MES-NaOH, pH 6,5, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 1 M Betain, 12,5 % Glycerin, 10 mM NaHCO3 rekonstituiert. 0,05 % α-DM, ergänzt mit frisch hergestelltem 350 µM 2,6-Dichlor-1,4-benzochinon (DCBQ) auf ein Endvolumen von 1 ml und in ein thermoreguliertes ALGi-Glasfläschchen gegeben, das mit einem Silikonstopfen verschlossen ist. Die O2-Konzentration wurde mit einem optischen O2-Sensor (Pyroscience FireSting, OXROB3-Sonde) ermittelt. Die Reaktionsmischung wurde entweder 5, 10, 20 oder 30 s lang einer Beleuchtung (370 µE m−² s−¹, weißes LED-Licht) ausgesetzt, mit einer kurzen Dunkelperiode zwischen den Belichtungen. Um anaerobe Bedingungen herzustellen, wurde durch eine Einlassnadel ein konstanter N2-Gasstrom in den Kopfraum des Fläschchens injiziert. Die O2-Werte wurden einige Minuten lang überwacht, bis die O2-Konzentration auf 10 μM gesunken war. Danach wurde die Nadel ausgeworfen und das Experiment wie oben beschrieben gestartet.

Zur Erzeugung biologischer Replikationen wurden vor jedem Experiment Zellkulturen aus einzelnen Kolonien beimpft. Da Abb. In den Tafeln 1, 2 und 4 a–c wird ein kinetisches Phänomen beschrieben. Die Ergebnisse werden in ihren ursprünglichen Spuren der gemittelten Ergebnisse dargestellt, um die Sichtbarkeit und Klarheit der Figuren zu verbessern. Die Wiederholungen zeigten das gleiche Änderungsverhältnis wie im Text beschrieben und dargestellt. Vor jedem Experiment wurden gereinigte PSII-Komplexe aus isolierten Thylakoiden geerntet, um eine Verschlechterung der Aktivität zu verhindern. Einzelwiederholungen und deren gemitteltes Ergebnis sind in der beigefügten ergänzenden Materialdatei (Ergänzungsdaten 1) dargestellt. Signifikante Unterschiede in allen Abbildungen zwischen anfänglicher und aufeinanderfolgender Belichtung wurden mithilfe eines Student-T-Tests in Microsoft Excel sowie der in den Abbildungen dargestellten Boxplots berechnet. 3 und 4d.

Alle Daten werden in diesem MS angezeigt, Excel-Dateien der Rohdaten stehen als ergänzendes Material zur Verfügung (Ergänzungsdaten 1). Im Falle einer weiteren Anfrage können zusätzliche Daten an alle Interessierten weitergegeben werden.

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Wir danken M. Hippler und F. Buchert von der WWU Münster für die konstruktive Diskussion. Wir danken N. Shahar von TAU, Israel, für die sorgfältige Lektüre des Manuskripts und für seine Kommentare sowie László Kovács (BRC Szeged) für seine Unterstützung bei den TL-Messungen. Diese Arbeit wurde durch das Lendület/Momentum-Programm der Ungarischen Akademie der Wissenschaften (LP2014/19-Forschungsstipendium an SZT) und das Nationale Büro für Forschung, Entwicklung und Innovation (K132600 und FK 135633) Forschungsstipendien an SZT und VN) unterstützt von der Israel Science Foundation (Fördernummer 941/22 an IY).

School of Plant Sciences and Food Security, The George S. Wise Faculty of Life Sciences, Universität Tel Aviv, Ramat Aviv, Tel Aviv, 69978, Israel

Yuval Milrad, Tamar Elman und Iftach Yacoby

Institut für Pflanzenbiologie, Biologisches Forschungszentrum, Szeged, Timisoara krt. 62, H-6726 Szeged, Ungarn

Valéria Nagy & Szilvia Z. Tóth

Abteilung für Biochemie, The George S. Wise Faculty of Life Sciences, Universität Tel Aviv, Ramat Aviv, Tel Aviv, 69978, Israel

Maria Fadeeva

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YM, SZT und IY gestalteten Forschung; YM, TE, VN und IY führten Untersuchungen durch; MF lieferte gereinigtes PSII; YM, SZT und IY analysierten Daten; YM, SZT und IY haben den Artikel verfasst.

Korrespondenz mit Iftach Yacoby.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Faisal Koua, Bill Rutherford und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: David Favero. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Milrad, Y., Nagy, V., Elman, T. et al. In anoxischen Grünalgenkulturen wird nach der Beleuchtung eine PSII-Photosynthesesteuerung aktiviert. Commun Biol 6, 514 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04890-3

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Eingegangen: 08. September 2022

Angenommen: 01. Mai 2023

Veröffentlicht: 12. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04890-3

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