3D-Melanom-Sphäroidmodell für die Entwicklung von Positronium-Biomarkern

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7648 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Kürzlich wurde gezeigt, dass die neu erfundene Positronium-Bildgebung zur Verbesserung der Krebsdiagnostik eingesetzt werden kann, indem sie zusätzliche Informationen über die Gewebepathologie im Vergleich zum derzeit in der Positronenemissionstomographie (PET) verfügbaren standardisierten Aufnahmewert liefert. Die Positronium-Bildgebung nutzt die Eigenschaften von Positroniumatomen, die aus den bei PET-Untersuchungen im Körper erzeugten Elektronen und Positronen aufgebaut werden. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Positronium-Bildgebung empfindlich auf die In-vitro-Unterscheidung tumorähnlicher dreidimensionaler Strukturen (Sphäroide) reagiert, die aus Melanomzelllinien mit unterschiedlichen Krebsaktivitäten und biologischen Eigenschaften bestehen. Die Lebensdauer von Orthopositronium (o-Ps) wurde in Melanomsphäroiden aus zwei Zelllinien (WM266-4 und WM115) bewertet, die sich im Stadium der Malignität unterschieden. Darüber hinaus haben wir Parameter wie die Zellzahl, die Sphäroidgröße und die Malignität des Melanoms berücksichtigt, um deren Zusammenhang mit der Lebensdauer der o-Ps zu bewerten. Wir demonstrieren Pilotergebnisse für die Messung der o-Ps-Lebensdauer in extrazellulären Matrix-freien Sphäroiden. Mit der statistischen Signifikanz von zwei Standardabweichungen haben wir gezeigt, dass die Lebensdauer von Orthopositronium umso kürzer ist, je höher der Malignitätsgrad und die Proliferationsrate neoplastischer Zellen sind. Insbesondere haben wir die folgenden Hinweise beobachtet, die weitere Forschungen ermutigen: (i) WM266-4-Sphäroide, die durch eine höhere Proliferationsrate und Malignität gekennzeichnet sind, zeigten eine kürzere o-Ps-Lebensdauer als WM115-Sphäroide, die durch eine geringere Wachstumsrate gekennzeichnet sind. (ii) Beide Zelllinien zeigten eine Verringerung der Lebensdauer von o-Ps nach der Sphäroidbildung am 8. Tag im Vergleich zu Tag 4 in Kultur, und die mittlere o-Ps-Lebensdauer war bei aus WM115-Zellen gebildeten Sphäroiden länger als bei denen, die aus WM266 gebildet wurden -4 Zellen, unabhängig vom Sphäroidalter. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass Positronium ein vielversprechender Biomarker ist, der in der PET-Diagnostik zur Beurteilung des Malignitätsgrades von Krebs eingesetzt werden kann.

In den letzten Jahrzehnten wurden dreidimensionale (3D) Zellkulturen häufig als In-vitro-Modelle verwendet, die die Lücke zwischen In-vitro- und In-vivo-Zellbedingungen schließen können1. Der Vergleich der 3D-Zellkultur mit einer Zellmonoschicht ergab einige spezifische physiologische und morphologische Eigenschaften, wie z. B. Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, Zellsignalisierung, Proliferation und Nekrose. Im Gegensatz zu einer einschichtigen Zellkultur ist ein 3D-Sphäroid ein geeignetes Modell, um die reale Tumorzellumgebung und die Nährstoffdiffusionsrate zwischen Zellen nachzuahmen. Mehrzellige Tumorsphäroide ermöglichen es uns, den biochemischen Mechanismus des Zellwachstums, enzymatische Reaktionen und verschiedene Behandlungsmodalitäten zu untersuchen2,3,4,5.

Das Melanom ist eine weit verbreitete Hautkrebsart, die als eine der tödlichsten Krebsarten eingestuft wird. Das Melanom ist die tödlichste Krebsart und eine multifaktorielle Erkrankung, bei der sowohl genetische Anfälligkeit als auch Umwelteinflüsse, vor allem gegenüber ultraviolettem Licht, eine wichtige Rolle spielen6. Als umweltbedingte Risikofaktoren für Melanomkrebs gelten die Exposition gegenüber solarer ultravioletter Strahlung (UVB) und Sonnenbrände (UVA). UVB-Bestrahlung führt zu direkten DNA-Schäden, die zu DNA-Strangbrüchen führen. UVB fördert auch das Überleben, die Angiogenese und die Invasion von Melanomzellen, da Makrophagen und Neutrophile vermehrt in Hautzellen eindringen. UVA verursacht DNA-Schäden durch die Produktion freier Radikale, die oxidativen Stress in Melanozyten auslösen. Das Risiko für ein Melanom kann auch mit vererbten Mutationen und somatischen Mutationen verbunden sein, die genetische Veranlagung ist jedoch nur für eine geringe Anzahl von Fällen verantwortlich. Da die Wirksamkeit der Melanombehandlung in fortgeschrittenen Stadien gering ist, besteht ein ständiger Bedarf an der Entwicklung neuer gezielter Therapien, Immuntherapien und Kombinationstherapien7 (Abb. 1).

Schematische Darstellung von Melanozyten und der Bildung einer Melanomläsion in der Epidermisschicht. (A) Normale Melanozyten haben eine regelmäßige dendritische Form und bilden viele Verzweigungsfortsätze, die sich zwischen zahlreichen Keratinozyten erstrecken (links). Ein Melanozyten erreicht zwischen 36 und 40 Keratinozyten und bildet eine epidermale Melanineinheit (EMU) mit einem ausgewogenen Verhältnis von einem Melanozyten zu jedem der 8–10 Keratinozyten in der Basalschicht der Epidermis. In einer Melanomläsion (rechts) verlieren Melanozyten ihre Dendrizität und werden bösartig und amöboid. Sie verändern ihre Zell-Zell-Kontakte, indem sie verschiedene Adhäsionsmoleküle exprimieren (N-Cadherin anstelle von E-Cadherin, das von Melanozyten exprimiert wird)7. Melanosomen speichern die von Melanozyten produzierten Melaninkörnchen, die auf die umliegenden Keratinozyten verteilt werden können, um sie vor Schäden durch UV-Strahlung zu schützen. (B) Bildliche Darstellungen von Positronenvernichtungen im Melaninmolekül. Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, p-Ps- und o-Ps-Atome werden in den in der Legende erläuterten Farben angezeigt. Gestrichelte Pfeile zeigen Photonen aus der direkten Elektron-Positron-Vernichtung. Rote Pfeile zeigen Photonen aus der Selbstvernichtung des o-Ps-Atoms. Blaue Pfeile zeigen Photonen aus der Selbstvernichtung von p-Ps. Grüne und braune Pfeile zeigen den Zerfall von o-Ps durch Aufnahme- bzw. Umwandlungsprozesse an.

Obwohl sich zahlreiche Studien mit der Diagnose von Melanomen im Frühstadium befassen, sind weitere Untersuchungen und Nachuntersuchungen erforderlich. Die Metastasierungsrate bei Melanompatienten ist mit 350.000 neuen Fällen pro Jahr hoch, und die Zahl der neuen Fälle steigt jedes Jahr deutlich an8,9,10.

In dieser Studie wurde ein 3D-Sphäroidmodell zweier Melanomzelllinien, WM266-4 und WM115, mit unterschiedlichen Malignitätsstadien ausgewertet. Die Melanomzelllinien WM266-4 und WM115 verfügen über verschiedene biologische Eigenschaften, die sie in Proliferation, Migrationsrate und Zellgröße unterscheiden. Die Aktivierung von Advanced Glycation End Products (AGEs), die bei der Kombination von Lipiden und Proteinen mit Zucker im menschlichen Stoffwechsel entstehen, und Proteinen wie dem Rezeptor für AGEs (RAGE) und c-Jun N-terminalen Kinasen (JNK) in Die WM266-4-Linie macht diese Zelllinie invasiver als die WM115-Linie11. Darüber hinaus ist die Expression des SLC7A5-Gens (Variante des Large Amino-acid Transporter 1) in WM115 höher als in WM266-4, im Gegensatz zur Expression des SLC7A8-Gens, die in WM115 niedriger ist als in WM266-412. Diese Gene sind am Aminosäureimport beteiligt und für die Zellpigmentierung essentiell. Die Zelllinie WM115 ist dunkler als die Zelllinie WM266-4.

In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass der Unterschied zwischen dem Malignitätsgrad der Melanomkrebsarten WM115 und WM266-4 auf der Ebene der Zellphysiologie durch Positronium-Biomarker untersucht werden kann. Ein Positronium ist ein exotisches Atom, das aus Positronen und Elektronen besteht13. Das Positronium wird auch bei der PET-Diagnose in den intramolekularen Räumen gebildet13. Im Gewebe kann sich das Positronium bilden und in den freien Hohlräumen der intramolekularen Räume einschließen, wie in Abb. 114 bildlich dargestellt. Das vom Radionuklid emittierte Positron (z. B. 18F in der PET-Diagnose oder 22Na in der typischen Positronenvernichtungslebensdauer). Spektroskopie (PALS)-Experimente) durchdringt das Objekt und vernichtet nach Energieverlust mit einem Elektron der Moleküle, aus denen die Zellen bestehen. Die Elektron-Positron-Vernichtung in Photonen kann direkt (e + e− → Photonen (schwarze gestrichelte Pfeile in Abb. 1B)) oder über ein Positroniumatom [e + e− → Positronium → Photonen (durchgezogene Pfeile in Abb. 1B)] erfolgen. In einem Viertel der Fälle entsteht das Positronium als kurzlebiger (125 ps) Zustand, der Parapositronium (p-Ps) genannt wird, und in drei Viertel der Fälle entsteht ein langlebiger Zustand (142 ns). ) Orthopositronium (o-Ps). Para-Positronium (in Abb. 1B blau dargestellt) zerfällt überwiegend in zwei Photonen (blaue Pfeile), und Ortho-Positronium zerfällt im Vakuum überwiegend in drei Photonen (rote Pfeile). In den intramolekularen Hohlräumen durchläuft Ortho-Positronium jedoch Prozesse wie Pick-off (das Positron von o-Ps vernichtet sich in zwei Photonen (grüne Pfeile) mit einem Elektron aus dem umgebenden Molekül) und die Umwandlung in Para-Positronium durch Wechselwirkung mit Molekülen wie Sauerstoffmoleküle. Das entstehende Parapositronium zerfällt in zwei Photonen (braune Pfeile). Der Bereich der mittleren o-Ps-Lebensdauerschwankung ist erheblich und variiert von 142 ns im Vakuum bis zu 1,8 ns in Wasser15,16. Daher hängt die Lebensdauer des Ortho-Positroniums stark von der molekularen Umgebung ab: der nanomolekularen Struktur und der Konzentration der bioaktiven Moleküle13,14,15,16,17,18,19. Die Eigenschaften von Positronium in biologischen Proben wurden bisher kaum untersucht. Erst kürzlich wurden die ersten Studien zu Positronium in 3D-Zellstrukturen durchgeführt, indem Zellen auf Kollagengerüsten kultiviert wurden20. Andere Studien an Hautkrebszellen (Basal- und Plattenepithelkarzinomen) wurden mit einem niederenergetischen Positronenstrahl durchgeführt, der das Eindringen in die Haut begrenzte21,22,23.

Die erste In-vitro-Untersuchung zur Lebensdauer von Positronium in Geweben von Patienten zeigte vielversprechende Ergebnisse im Hinblick auf die Anwendung von Positronium als Biomarker für die Diagnose von Gebärmutterkrebs und Myxomkrebs sowie als Biomarker für Hypoxie24,25,26,27. Kürzlich wurde Positronium als neuartiger Biomarker für die In-vivo-Beurteilung von Gewebepathologien vorgeschlagen13,25, der mit einer neu entwickelten Positronium-Bildgebungsmethode15,19,26,28 abgebildet werden kann, wenn sofortige Photonenradionuklide28,29,30,31 und hochwirksame Photonenradionuklide angewendet werden. Empfindlichkeit PET-Scanner28. Darüber hinaus wird die Einführung von Ganzkörper-PET-Systemen, die sich durch eine hohe Empfindlichkeit auszeichnen,32,33,34,35 die gleichzeitige Anwendung der Positronium-Bildgebung zur Standard-Stoffwechselbildgebung während der Positronen-Emissions-Tomographie29,36,37 ermöglichen.

Das Ziel dieser Studie bestand darin, festzustellen, ob die Positronium-Bildgebung empfindlich auf die In-vitro-Unterscheidung tumorähnlicher dreidimensionaler Strukturen (Sphäroide) reagiert, die aus Melanomzelllinien mit unterschiedlichen Krebsaktivitäten und biologischen Eigenschaften aufgebaut sind.

Zwei Melanomzelllinien, WM266-4, eine humane maligne Melanomkrebszelllinie, und WM115, eine Zelllinie eines primären Melanoms, wurden von der ESTDAB Melanoma Cell Bank (Tübingen, Deutschland) gekauft und wie zuvor beschrieben kultiviert38. Ein automatischer Zellzähler Luna-II™ (Logos Biosystems, Inc.) wurde verwendet, um die Zellzahl und die Lebensfähigkeit vor der Zellaussaat zu bestimmen.

Beide Zelllinien, WM266-4 und WM115, wurden in 5D-Kugelplatten (5D sp5dplate, Kugelmeiers, Schweiz) ausgesät, um Sphäroide zu bilden39. Die 5D-Mikroplatte verfügt über 24 Vertiefungen, 12 Vertiefungen mit nanobeschichteter Oberfläche zur Sphäroidbildung und 12 Vertiefungen als Kontrolle. In unserer Studie wurden keine Kontrollbrunnen verwendet. Jede Vertiefung enthält 750 Mikrokavitäten (mit einem Durchmesser von 509 µm und einer Tiefe von 320 µm), die durch scharfe Grenzen voneinander getrennt sind. Diese Grenzen verhindern die Zellmigration von einer Mikrokavität zur anderen. Somit können 9000 Sphäroide mit einheitlichen Formen und Durchmessern in einer einzigen Platte kultiviert werden.

Zur Zellaussaat wurden jeder Vertiefung 0,5 ml Vollmedium zugesetzt. Anschließend wurden 0,5 ml zusätzliches Medium mit 1.125.000 Zellen/Well (1500 Zellen/Mikrowell) in jedes Well der Platte gegeben. Die Zellen im Falcon-Röhrchen wurden resuspendiert, um sie im gesamten Medium zu verteilen, und dann in die Vertiefungen gegeben.

Nach der Zellaussaat wurden die Platten in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 mit Luftfeuchtigkeit aufbewahrt. Das Zellkulturmedium wurde jeden Tag nach der Bildung der Sphäroide erneuert. Zur Messung der mittleren o-Ps-Lebensdauer wurden zwei geeignete Zeitpunkte des Sphäroidwachstums ausgewählt. Sphäroidmorphologie und Proliferationsrate wurden auch unter einem optischen Mikroskop (Olympus, IX-LWPO, T2, Japan) an den Tagen 4 und 8 nach der Zellaussaat bestimmt. Die Bildanalyse wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.

Zunächst wurden Sphäroide mit Trypsin/EDTA (Gibco, Kat.-Nr. 25200072, Waltham, MA USA) zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert. Anschließend wurden 100 µl Trypsin/EDTA-Sphäroide 10–20 Minuten bei 37 °C inkubiert und mehrmals pipettiert, um die Zellen zu trennen. Anschließend wurden die Zellen 3 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, der Überstand entfernt und 100 µl Medium (Gibco, Kat.-Nr. 10010056, Waltham, MA, USA) zu den Zellen gegeben und mehrmals pipettiert, um die Zellen zu trennen vollständig. Im letzten Schritt wurden 10 µl Zellen zu 10 µl Trypanblau gegeben und gezählt (Zellzähler Luna-II™, Logos Biosystems, Aligned Genetics, Inc). Der Arbeitsablauf ist in Abb. 2 dargestellt. Jeder Lebensfähigkeitstest wurde bei jeder Messung an 4 verschiedenen Proben unter den gleichen Bedingungen durchgeführt.

Arbeitsablauf zur Untersuchung der Lebensfähigkeit von Sphäroiden nach der Ernte von 3D-Sphäroiden aus 5D-Mikroplatten.

Nach 15 Minuten im Inkubator wurden die Zellen überprüft, um sicherzustellen, dass keine Aggregate vorhanden waren. Nach dem Lebensfähigkeitstest mit dem Zellzähler wurde die Zellclusterkarte ausgewertet, um den Prozentsatz der Cluster zu bestimmen. In unseren Experimenten zeigten Clusterkarten einen hohen Prozentsatz an Dissoziation, über 90 %. Anschließend wurde die Zellgröße beider Zelllinien in 3D-Form durch Zellzähler und mikroskopische Untersuchungen überprüft. Zur Abschätzung der Zellgröße

Es wurde ein Luna II™ Zellzähler verwendet. Bezüglich des Histogramms der Größenverteilung wurde der mittlere Durchmesser der Zellen geschätzt. Zum Vergleich wurde auch die Größe der Zellen in 2D-Kulturen bestimmt. Zu diesem Zweck wurden aus jeder Vertiefung Sphäroide mit einer 3-ml-Pipette mit großer Bohrung entnommen, um eine Zerstörung der Sphäroidstruktur zu vermeiden. Anschließend wurden die Sphäroide auf ein 15-ml-Falcon-Röhrchen gegossen und 7 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Im nächsten Schritt wurde der Überstand entfernt und den Sphäroiden 1 ml frisches Medium zugesetzt.

Um die Glukoseaufnahme zu bewerten, wurde eine fluoreszenzemittierende d-Glukosesonde 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-desoxyglukose) (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. N13195) verwendet. Um die Verteilung der Sauerstoffaufnahmerate in den Sphäroiden zu beurteilen, wurden WM266-4- und WM115-Zellen in Dichten von 1000 und 2000 Zellen/Tropfen ausgesät. An den Tagen 4 und 8 wurden die Sphäroide in Glasbodenschalen überführt und jedem Sphäroid 20 μl 2-NBDG (200 μM) zugesetzt. Die Sphäroide wurden 45 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Schließlich wurden die Sphäroide mit PBS gewaschen und Sphäroidbilder mit einem Nikon Eclipse Ti-E-Mikroskop aufgenommen, das an ein konfokales A1-Scanning-System (Nikon, Japan) bei einer Fluoreszenzwellenlänge von 494 nm/551 nm gekoppelt war.

Die Verteilung der Sauerstoffaufnahmerate wurde mit einem Hypoxie-Kit, Image-IT™ Green Hypoxia Reagent (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. I14834), bestimmt. Um die Verteilung der Sauerstoffaufnahmerate in den Sphäroiden zu beurteilen, wurden WM266-4- und WM115-Zellen in Dichten von 1000 und 2000 Zellen/Tropfen ausgesät. An den Tagen 4 und 8 wurden die Sphäroide in Glasbodenschalen überführt und jedem Sphäroid wurden 20 μl Image-IT™ Hypoxie-Reagenz (10 μM) zugesetzt. Die Sphäroide wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Der Hypoxie-Farbstoff wurde durch frisches Wachstumsmedium ausgetauscht und die Sphäroide für die nächsten 4 Stunden erneut in einen Zellkultur-Inkubator gegeben. Sphäroidbilder wurden mit einem Nikon Eclipse Ti-E-Mikroskop aufgenommen, das an ein konfokales A1-Scanning-System (Nikon, Japan) gekoppelt war, bei einer Fluoreszenzwellenlänge von 488 nm/520 nm.

Um zuverlässige und präzise Ergebnisse der Positronium-Lebensdauer in Sphäroiden zu erhalten, verwendeten wir Sphäroide ohne Medium, Überstand oder chemische Verbindungen. Bei dieser Methode wurden geerntete Sphäroide aus den Mikroplatten nach Zentrifugation und vollständiger Entfernung des Mediums von den Sphäroiden für die Positronium-Lebensdauermessung vorbereitet.

Die Positronium-Lebensdauer wurde mit einem Spektrometer gemessen, das aus zwei vertikal angeordneten BaF2-Kunststoffszintillatoren (SCIONIX, Holland) und zwei Photomultipliern mit den Seriennummern SBO696 und SBO697 (Hamamatsu, Japan) bestand, die von einem Hochspannungsnetzteil (CAEN SY4527) betrieben wurden. Die Signale von Photomultipliern wurden mit dem 6000A-Datenanalysator-Oszilloskop (Le Croy) ausgelesen und analysiert. Sphäroide wurden mit Positronen bestrahlt, die von dem in Kaptonfolie platzierten 22Na-Radionuklid (mit einer Aktivität von etwa 1 MBq) emittiert wurden. Als Behälter für die Sphäroide wurde eine spezielle Aluminiumkammer verwendet und ein Halter mit einer Heizung verbunden, um die Zellen auf 37 °C zu halten. Der Messaufbau ist in Abb. 3 bildlich dargestellt.

Sphäroide, die die 22Na-Quelle umgeben, befinden sich in der speziellen Kammer zwischen zwei BaF2-Detektoren. Die Sphäroide befinden sich neben der 22Na-Quelle und es gibt keinen Raum oder eine Blase zwischen ihnen. Für jede Messung wurden 106 Ereignisse mit der gleichzeitigen Registrierung von 511-keV-Photonen und 1274-keV-Photonen gesammelt.

Das 22Na-Radionuklid wandelt sich nach der Emission des Positrons in den angeregten Zustand des 22Ne-Isotops um, das durch Emission des 1274 keV-Gammaquants abregt (durchschnittlich nach 2,6 ps)29,30. Das Positron verliert beim Durchgang durch die Zellen Energie und vernichtet sich schließlich mit dem Elektron in zwei aufeinanderfolgende 511-keV-Gammaquanten. Die Positron-Elektron-Vernichtung kann direkt oder über die Bildung des Positroniums erfolgen. Die Zeit zwischen der Emission des Positrons und seiner Vernichtung wird durch die Registrierung des 1274 keV-Abregungsphotons und eines der 511 keV-Vernichtungsphotonen gemessen. Die Probe mit der Quelle ist so positioniert (siehe Abb. 3), dass die gleichzeitige Registrierung von 1274 keV-Gamma und einem 511 keV-Photon möglich ist und die gleichzeitige Registrierung beider 511 keV-Photonen, die Rücken an Rücken fliegen, verhindert wird. Ein als Ergebnis der Messung ermitteltes beispielhaftes Lebensdauerspektrum ist in Abb. 4 dargestellt.

Beispiel eines Positronium-Lebensdauerspektrums. Experimentelle Daten (schwarzes Histogramm) mit überlagerten Histogrammen, die aus der Anpassung der Summe der mit der Detektorauflösung gefalteten Exponentialfunktion resultieren, durchgeführt mit dem PALS Avalanche-Programm25,40. Die erste Komponente (gelbe Linie) zeigt den Beitrag von p-Ps (mittlere Lebensdauer: 0,125 ns), die zweite Komponente (grüne Linie) stammt von Annihilationen in der Quelle (Kaptonfolie) (0,374 ns), die dritte Komponente (hellblau). ) zeigt die Lebensdauer der freien Annihilation (0,395 ns) und die vierte Komponente (dunkelblau) veranschaulicht den Beitrag von o-Ps. Die Summe aller aus dem Fit resultierenden Beiträge wird als rote Kurve dargestellt.

Vor jeder Messung wurde das System mit einer leeren Kammer kalibriert, die nur die 22Na-Quelle enthielt. Zur Durchführung der Messung wurden Sphäroide mit einem Scalper aus dem Zentrifugenröhrchen in die Kammer überführt und zwischen den Proben radioaktive 22Na-Quellen platziert. Dann wurde die Sphäroidprobe neben der Quelle platziert, ohne Luft zwischen der Quelle und den Sphäroiden. Anschließend wurde die Kammer in einen Halter gestellt, der mit einer Heizung verbunden war, um die Zellen auf 37 °C zu halten. Schließlich wurde der Halter zwischen zwei BaF2-Detektoren platziert, wie in Abb. 3 dargestellt.

Die Lebensdauer von Positronium in Sphäroiden zu zwei verschiedenen Zeitpunkten, dem 4. und 8. Tag nach der Aussaat der Zellen, wurde auf der Grundlage der 106 gesammelten Ereignisse für jeden untersuchten Fall bewertet. In dieser Studie wurden nur Sphäroide ohne Medium, Wasser und jegliche Chemikalien bewertet.

Die Positronium-Lebensdauer wurde aus jedem aufgezeichneten Spektrum extrahiert, indem die Summe von vier Exponentialfunktionen angepasst wurde, die mit der Detektorauflösungsfunktion gefaltet wurden40,41. Das beispielhafte Spektrum mit dem Ergebnis der Anpassung ist in Abb. 4 dargestellt. Die angepassten Komponenten entsprechen dem Zerfall von Para-Positronium (gelbe Kurve), der direkten Annihilation in der Quelle/Kapton-Folie (grüne Kurve) und der Annihilation von Ortho- Positronium (dunkelblau). Das gesamte Experiment wurde dreimal wiederholt.

Die beispielhaften in der Mikroplatte gezüchteten Sphäroide sind in Abb. 5 dargestellt. Die Zelllinie WM266-4 bildete kugelförmigere und konzentriertere Sphäroide als die Zelllinie WM115, wie bereits berichtet38. Sphäroide in beiden Zelllinien zeigten im Laufe der Zeit eine Zunahme ihrer Größe und Zirkularität. Im Allgemeinen hängen die Wachstumsgeschwindigkeit und die Größe von Sphäroiden von der Größe der Hohlräume und der Art der bepflanzten Platten ab. Je größer die Mikrokavitäten sind, desto größer sind die gebildeten Sphäroide⁠. Obwohl die Größe der Sphäroide durch die anfängliche Aussaat der Kultur gesteuert werden kann, kann die Größe der Mikrovertiefungen auch den Durchmesser der Sphäroide beeinflussen42.

Vergleich von Sphäroiden aus verschiedenen Melanomzelllinien. (A) Mikroskopische Bilder von zwei verschiedenen Zelllinien, WM266-4 und WM115, an den Tagen 4 und 8 der Kultivierung. Die Dichte und Zirkularität der Sphäroide nahm während der Kulturzeit zu. (B) Als Funktion der Kultivierungszeit zeigten WM266-4-Sphäroide ein höheres Volumen als WM115-Sphäroide. (C) Die Anzahl der Zellen in der Platte wurde während der Kulturzeit für beide Zelllinien erhöht. Die Anzahl der Zellen in einer Platte wurde nach der Sphäroidernte mit dem Zellzähler Luna II berechnet.

Abbildung 5B,C zeigt, dass die Sphäroide WM266-4 und WM115 im Laufe der Zeit wuchsen. WM266-4-Sphäroide zeigten eine schnellere Proliferationsrate als WM115-Sphäroide, die zu ihren bösartigen Eigenschaften zurückkehrten.

Abbildung 5B zeigt, dass die Zellzahl von der Zellaussaat bis zum 8. Tag nach der Kultivierung zunahm. Die Teilungsrate von WM266-4-Zellen in Sphäroiden war höher als die von WM115-Zellen. WM266-4 führte zu einem 1,5- bzw. 2,74-fachen Anstieg der Zellzahl nach 4 bzw. 8 Tagen. Die Anzahl der Zellen in WM115-Sphäroiden stieg nach 4 bzw. 8 Tagen um das 1,4- bzw. 1,7-fache. Bei jeder Positronium-Lebensdauermessung wurden insgesamt 36.000 Sphäroide verwendet.

Die WM266-4-Sphäroide umfassten Zellen mit einem Durchmesser von 15,70 ± 0,10 μm am Tag 4 nach der Zellaussaat und 15,92 ± 0,08 μm am Tag 8, während der Durchmesser der WM155-Sphäroidzellen am Tag 4 16,66 ± 0,20 μm und am Tag 17,28 ± 0,25 betrug μm am Tag 8. Die mittlere Größe der gefärbten Zellen in der 2D-Zellkultur war kleiner als die Größe der Zellen aus den 3D-Sphäroiden, 14,65 ± 0,09 μm und 16,27 ± 0,10 μm für WM266-4 bzw. WM115.

Die Anzahl der Zellen in beiden Zelllinien nahm mit der Zeit zu. Das beobachtete Wachstum war bei der Zelllinie WM266-4 schneller als bei der Zelllinie WM115. WM115 hat eine längere Verdopplungszeit als WM266-4, etwa 7,5 bzw. 6 Tage, was bedeutet, dass Zellen der Linie WM115 mehr Zeit in ihrem Zellzyklus verbringen als Zellen der Linie WM266-4. Die Verdopplungszeit (DT) von Sphäroiden wird normalerweise als die tatsächliche Tumorverdopplungszeit charakterisiert und unter Verwendung des Sphäroidvolumens berechnet über:

wobei V1 und V2 Sphäroidvolumina zu den Zeitpunkten t1 bzw. t2 = t1 + t nach der Aussaat sind43,44,45.

Gemäß der Fluoreszenzintensitätsanalyse (Abb. 6) wurde der Bereich zwischen 100 und 200 µm vom Zentrum eines Sphäroids als äußere Schicht, auch Proliferationsrand genannt, und der Bereich zwischen 50 und 100 µm als innerer Teil betrachtet Das Sphäroid wurde als nekrotischer Kern betrachtet. Allerdings hängt die Größe der verschiedenen Schichten eines Sphäroids von der Größe des Sphäroids ab. Die Fluoreszenzintensität nach 4 Tagen in Sphäroiden, die aus einer anfänglichen Anzahl von 1000 Zellen am Rand der WM266-4-Sphäroide erhalten wurden, war nicht signifikant höher als die für WM115 (p = 0,20), während im tieferen Bereich der Sphäroide eine höhere Intensität zu verzeichnen war Die Glukoseaufnahme wurde bei WM266-4-Sphäroiden beobachtet als bei WM115-Sphäroiden (p = 0,00001). Größere Sphäroide, die aus 2000 Zellen gebildet wurden, zeigten nach 4 Tagen eine höhere Glukoseaufnahme, und die Intensität war im Proliferationsrand (p = 0,04) und im Kernbereich bei WM266-4-Sphäroiden signifikant höher als bei WM115-Sphäroiden (p = 0,0018). Am 8. Tag zeigten WM266-4- und WM115-Sphäroide einen signifikanten Unterschied in der Intensität der Glukoseaufnahme im Proliferationsrand (p = 0,007), nicht jedoch im Kern (p = 0,064) (Abb. 6).

Bestimmung der Glukoseverteilung in Melanomsphäroiden. Die Glukosekonzentration wird im Proliferationsrand bei WM266-4-Sphäroiden (A) und weiter verteilten WM115-Zelllinien (B) gleichmäßig verteilt beobachtet, mit signifikanten Unterschieden bei den größeren und älteren Sphäroiden. Diagramm der Glukoseverteilung in den Sphäroiden WM266-4 (C) und WM115 (D) zu zwei verschiedenen Kulturzeitpunkten, ermittelt mit der 2-NBDG-Sonde.

Am Tag 4 der Kultur war das Fortschreiten der Hypoxie, gemessen als Fluoreszenzintensität, in Sphäroiden mit einer anfänglichen Zellzahl von 1000 nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,05), während am Tag 8 der Grad der Hypoxie im Zentrum der WM266-4-Sphäroide gemessen wurde war signifikant höher als die von WM115-Sphäroiden (p = 0,0001). Bei den größeren Sphäroiden während der Kultur war der Grad der Hypoxie bei WM266-4-Sphäroiden signifikant höher (p < 0,001) als bei WM115-Sphäroiden, während am 8. Tag bei WM266-4- und WM115-Sphäroiden ein signifikanter Unterschied im Fortschreiten der Hypoxie auftrat in ihrer Mitte (p = 0,00048), aber nicht im äußeren Teil (p = 0,24) (Abb. 7).

Bestimmung des Fortschreitens der Hypoxie in Melanomsphäroiden. Die hypoxische Region wird im Zentrum der Sphäroide in (A) WM266-4- und (B) WM115-Zelllinien beobachtet, mit signifikanten Unterschieden bei den größeren und älteren Sphäroiden. Diagramm der Hypoxieverteilung in den Sphäroiden WM266-4 (C) und WM115 (D) zu zwei verschiedenen Kulturzeitpunkten, ermittelt mit der Image-IT™ Green Hypoxia-Sonde.

Die mittlere Lebensdauer von Orthopositroniumatomen in den Sphäroiden wurde für zwei verschiedene Zelllinien ermittelt, die durch unterschiedliche Malignitätsgrade gekennzeichnet sind: WM115 und WM266-4. Beide Messungen wurden für Sphäroide zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt: am 4. und 8. Tag nach der Aussaat. Die Lebensfähigkeitstests wurden vor und nach jeder PALS-Messung ausgewertet und zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Sphäroide bis zum 8. Tag konstant über 85 % blieb. Somit befanden sich die Sphäroide während des Experiments in einem guten und stabilen Zustand.

Die Messung der Positronium-Lebensdauer wurde dreimal wiederholt. Bei jeder Messung wurden Sphäroide von der Platte geerntet und in die Kammer gegeben.

Abbildung 8 zeigt die Ergebnisse der mittleren o-Ps-Lebensdauer und -Verteilung in 3D-Melanom-Sphäroiden mit unterschiedlichem Malignitätsgrad in zwei verschiedenen Altersstufen.

Vergleich der mittleren o-Ps-Lebensdauer und -Intensität für verschiedene Melanomzelllinien. (Links) Die Lebensdauer von o-Ps in den Sphäroiden WM266-4 (schwarze Quadrate) und WM115 (rote Punkte) in zwei verschiedenen Altersstufen, 4 und 8 Tage nach der Zellaussaat. (Rechts) Intensität der o-Ps-Produktion in WM266-4-Sphäroiden (schwarze Quadrate) und WM115-Sphäroiden (rote Punkte) als Funktion der Zeit. Um die mittleren o-Ps in Bezug auf den Sphäroidstoffwechsel zu vergleichen, sehen Sie sich bitte die Zusatzdatei 1 an.

Die erhaltenen Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass WM266-4-Sphäroide mit höherer Malignität, Proliferationsrate und hoher Zellkonzentration in Sphäroiden eine kürzere mittlere Ortho-Positronium-Lebensdauer als WM115-Zellen und daher kleinere freie intermolekulare Hohlräume als WM115-Zellen aufweisen der Primärtumor mit geringerer Teilungsrate und geringerer Zellkonzentration im Laufe der Zeit. Obwohl beide Zelllinien während der Kultivierungszeit eine allmähliche Abnahme der Lebensdauer von o-Ps zeigen, zeigen o-Ps in WM115 eine längere Lebensdauer als in WM266-4-Sphäroiden. Die Intensität in WM266-4-Sphäroiden blieb nahezu konstant, während WM115-Sphäroide eine Abnahme der Intensität von < 3SD > aufweisen, was als Veränderungen auf molekularer Ebene in WM115-Sphäroidzellen angesehen werden kann.

Kürzlich wurde die Positronium-Bildgebung eingeführt14,15,19,46 und die ersten In-vitro-Positronium-Bilder wurden demonstriert25,26, was neue Möglichkeiten für die Verbesserung der Krebsdiagnose durch die Verwendung von Positronium als Biomarker für die Gewebepathologie eröffnet13,14.

Das Hauptziel dieser Studie bestand darin, die Hypothese zu testen, dass Positronium als neuartiger Biomarker zur Beurteilung der verschiedenen Krebsaktivitäten und biologischen Eigenschaften in Krebszellen dienen könnte, und erste Studien zu Positroniumeigenschaften in 3D-Zellsphäroiden durchzuführen. Um diese Hypothese zu testen, wurden 3D-Sphäroide verwendet, da sie die Struktur echter Tumore unter physiologischen Bedingungen nachahmen können. Die Morphologie und Zell-Zell-Interaktionen in 3D-Sphäroiden unterscheiden sich völlig von denen in Monoschicht-Zellkulturen. Darüber hinaus bieten sie gegenüber Standardforschungsmethoden bestimmte Vorteile, darunter niedrige Nutzungskosten, hohe Reproduzierbarkeit, Zeitersparnis und einen geringeren Bedarf an Labortiermodellen. Die einzigartigen Eigenschaften von 3D-Tumorsphäroiden machen sie für biologische Experimente und Arzneimitteltests in einer Vielzahl experimenteller Studien mit Schwerpunkt auf Chemotherapie und Strahlentherapie von unschätzbarem Wert1,2,3,4,5,47,48.

Die Zellzykluszeit in 2D-Zellen und 3D-Sphäroiden unterscheidet sich erheblich, da Zellen in Monoschicht-Zellkulturen homogene biologische Bedingungen aufweisen; In einer konfluenten Monoschicht befinden sich die meisten Zellen im selben Zellzyklus und haben ausreichenden Zugang zu Nährstoffen und Sauerstoff. In 3D-Zellkulturen mit einer mehrschichtigen Struktur befinden sich Zellen in unterschiedlichen Zellzyklen und der Zugang zu den zum Überleben notwendigen Nährstoffen hängt von ihrer Entfernung von der Oberfläche ab49. Während des Zellzyklus wachsen Zellen in der G1-Phase bis zum Ende der G2-Phase heran, wenn nach Passieren der Kontrollpunkte Mitose und Teilung beginnen. In Sphäroiden ist der Raum für die Proliferation begrenzt und es bildet sich ein nekrotischer Kern, der von einer Ruheschicht umgeben ist, in der die Zellen in der G1-Phase des Zyklus angehalten werden, und einem proliferierenden Rand am äußersten Teil der Sphäroide, wo die Zellen im S verbleiben können /G2/M Phase50. In unserer Studie wurde ein signifikanter Unterschied in der Dynamik der Sphäroidbildung und Zellproliferation beobachtet. Wir beobachteten, dass die bösartigere Zelllinie (WM266-4) größere Sphäroide (sowohl am 4. als auch am 8. Tag in der Kultur) mit einer höheren Anzahl von Zellen bildete (Abb. 5B, C) und der Zelldurchmesser in den Sphäroiden geringer war das in der primären Melanomzelllinie (WM115).

Frühere Untersuchungen zur Positronium-Lebensdauer wurden hauptsächlich an verschiedenen Gewebetypen und einschichtigen Zellkulturen durchgeführt, beispielsweise an Hautkrebs- und Darmkrebszellen20,21,22,23,46,51,52. In dieser neuartigen Forschung wurde die Lebensdauer von Positronium in 3D-Sphäroiden und nicht in 2D-Zellkulturen oder -Geweben bewertet. Obwohl viel Forschung zu Positronium in Materialien und biologischen Proben durchgeführt wurde, beschränkt sich die Forschung mit 3D-Zellaggregaten auf die Bestimmung der o-Ps-Lebensdauer in 3D-Kolorektalkrebs-Zellaggregaten mit einer Mischung aus Zellen und Kollagen20. Die mittlere o-Ps-Lebensdauer erwies sich als empfindlicher Indikator für das mittlere Hohlraumvolumen in 3D-Krebskulturen, die mit dem Wachstumsfaktor stimuliert wurden, der die Stimulation der Epithelzellen beeinflusst (TGF-β). Mit TGF-β behandelte Kolonien zeigten 2–3 Wochen nach der Stimulation ein Wachstum mit dem mittleren o-Ps, das in der Spätphase der Kultur auf den Wert unter Kontrollbedingungen abnahm19. Diese o-Ps-Verteilung deutete auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Zelldynamik und mittleren molekularen Hohlräumen hin. Das Diffusionsverhalten kleiner Moleküle (Å) wurde mithilfe von PALS in verschiedenen biologischen Proben (Haare, Federn, Baumwolle und Seide) untersucht und zeigte, dass o-Ps empfindlich auf die Untersuchung von Hohlräumen in biologischen Polymeren reagieren53,54. Die Lebensdauer von o-Ps in der Zelle kann aufgrund der Zelloberfläche, des Zellwachstums und der Form der Zellen von der Lebensdauer abweichen, die gemessen wird, wenn sich die Zelle in einem Medium befindet, das Wasser, Kollagen oder andere chemische Verbindungen enthält geändert.

In unserer Studie haben wir uns auf das frühe Stadium der spontanen Proliferation zweier verschiedener Krebszelllinien konzentriert. Diese Zelllinien unterscheiden sich in der Zellgröße, wobei WM155-Zellen größer sind als WM266-4-Zellen. Daher kompensieren WM266-4-Zellen während der Sphäroidbildung ihre geringere Größe durch eine höhere Proliferationsrate, um größere Sphäroide zu bilden. Ihre Verdopplungszeit war kürzer als die von WM115-Zellen, und WM266-4-Zellen verbrachten weniger Zeit in ihrem Zellzyklus als WM115-Zellen. Diese wichtigen Unterschiede in der Zelldynamik im frühen Stadium des Sphäroidwachstums wurden durch die kürzere o-Ps-Lebensdauer für die WM266-4-Sphäroide am 4. Tag der Kultur angezeigt. In unserer vorherigen Studie haben wir den Prozentsatz lebensfähiger Zellen verglichen, der mit dem FDA/PI-Fluoreszenztest (Fluoresceinacetat und Propidiumiodid) in situ ermittelt wurde, und wir konnten keinen Unterschied zwischen der Lebensfähigkeit der Zellen in der frühen Phase der Sphäroidbildung (on) beobachten Tag 4) für diese beiden Melanomzelllinien, jedoch wurde in den WM115-Sphäroiden im Vergleich zu WM266-4 ein größerer nekrotischer Kern erkannt (29,36 vs. 13,66 % der toten Zellen)38. Diese Ergebnisse stimmen mit den Glukose- und Hypoxieverteilungstests überein, bei denen der Kern des Sphäroids als die Region mit der niedrigsten Glukosekonzentration und den höchsten hypoxischen Bedingungen erkannt wurde. Eine verringerte Glukosekonzentration (möglicherweise verursacht durch verringerte Diffusion oder erhöhten anaeroben Stoffwechsel – Glykolyse) wurde bei älteren Sphäroiden (Tag 8 in Kultur) und solchen, die aus mehr Zellen gebildet wurden, beobachtet (Abb. 6). Interessanterweise ermöglichte die unregelmäßige Form von WM115 der Fluoreszenzsonde, tiefer in den Kern einzudringen, was als Peak der Fluoreszenzintensität im Bereich zwischen 50 und 75 µm vom Zentrum des Sphäroids beobachtet wurde (Abb. 6D). Diese Glukoseverfügbarkeit kann den anaeroben Glukosestoffwechsel (Glykolyse) in der WM115-Zelllinie erleichtern und möglicherweise mit der höheren mittleren Lebenszeit von o-Ps unter diesen Bedingungen zusammenhängen.

Wir haben auch zusätzliche Messungen durchgeführt, um die o-Ps-Lebensdauer in 2D- und 3D-Zellkulturen zu vergleichen. Die erhaltenen Ergebnisse (Abb. 9) zeigen, dass die Positronium-Lebensdauer in 3D-Zellkulturen kürzer ist als in 2D-Zellkulturen55. Diese Grafik zeigt, wie sich die mittlere o-Ps-Lebensdauer zwischen 2- und 3D-Zellkulturen unterscheidet, was auf ihre Vielfalt in den biologischen Eigenschaften und im Stoffwechsel zurückzuführen ist. Die Zelllinien WM155 und WM266-4 zeichneten sich durch unterschiedliche Genexpressionen aus, z. B. diejenigen, die für den Aminosäuretransport verantwortlich sind, und viele andere, die mit der Bildung von Zellverbindungen, Migration und Mobilität zusammenhängen12,56.

Vergleich der mittleren Positronium-Lebensdauer in 2D- und 3D-Zellkulturen von Melanomen. Die Lebensdauer von o-Ps in der 2D-Zellkultur WM266-4 (schwarzes Quadrat) gemäß Ref. 55, die Lebensdauer von o-Ps in der 2D-Zellkultur WM266-4 (schwarzes Dreieck) und die Lebensdauer von o-Ps in WM266 -4 3D-Zellkultur (schwarze Punkte) zeigen die Lebensdauer von o-Ps in Sphäroiden zweier unterschiedlichen Alters, 4 und 8 Tage nach der Zellaussaat.

Diese Studie wurde durchgeführt, um die Lebenszeitverteilung von Orthopositronium in WM266-4- und WM115-Melanomzellsphäroiden zu bewerten, die durch unterschiedliche Malignitätsgrade gekennzeichnet sind. Die Messungen wurden zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (4 und 8 Tage) nach der Aussaat durchgeführt. Während dieser Zeit zeigten beide Sphäroidzelllinien eine Verkürzung der o-Ps-Lebensdauer, was auf die allmähliche Zellproliferation in Sphäroiden zurückzuführen ist. Bösartigere WM266-4-Sphäroide zeigten eine kürzere o-Ps-Lebensdauer als WM115-Zelllinien-Sphäroide.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Lebensdauer von o-Ps ein nützlicher Parameter zur Unterscheidung zwischen Krebszellen mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften ist. Je höher der Malignitätsgrad und die Proliferationsrate neoplastischer Zellen ist, desto kürzer ist die Lebensdauer von Orthopositronium. Diese Forschung ebnet den Weg für die Entwicklung von Positronium-Biomarkern unter Verwendung eines Zellsphäroidmodells.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze mit numerischen Daten, mathematischen Modellen und Berechnungsergebnissen, einschließlich Anpassungsdiagrammen, sind im Jagiellonen-Universitätsrepository (RUJ) unter dem Link https://ruj.uj.edu.pl/xmlui verfügbar /handle/item/29740557.

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Diese Arbeit wurde von der Stiftung für polnische Wissenschaft (FNP) durch das Programm TEAM POIR.04.04.00-00-4204/17 und vom Nationalen Wissenschaftszentrum Polens durch Zuschüsse Nr. unterstützt. 2019/33/B/NZ3/01004, 2021/42/A/ST2/00423 und 2021/43/B/ST2/02150, die Jagiellonen-Universität über die Projekte CRP/0641.221.2020, SciMat und qLife Priority Research Areas Budget im Rahmen des Programm Exzellenzinitiative – Forschungsuniversität und das DSC-Stipendium Nr. N17/MNS/000023 Frau Hanieh Karimi, für ihre Doktorarbeit.

Abteilung für Medizinische Physik, M. Smoluchowski-Institut für Physik, Fakultät für Physik, Astronomie und Angewandte Informatik, Jagiellonen-Universität, Łojasiewicza 11 Street, 30-348, Krakau, Polen

Hanieh Karimi & Ewa Ł. Stępień

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Hanieh Karimi

Abteilung für experimentelle Teilchenphysik und Anwendungen, M. Smoluchowski-Institut für Physik, Fakultät für Physik, Astronomie und Angewandte Informatik, Jagiellonen-Universität, Krakau, Polen

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Paweł Moskal & Ewa Ł. Stepien

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Agata Zak

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Korrespondenz mit Ewa Ł. Stępień.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Karimi, H., Moskal, P., Żak, A. et al. 3D-Melanom-Sphäroidmodell für die Entwicklung von Positronium-Biomarkern. Sci Rep 13, 7648 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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Eingegangen: 19. Juni 2022

Angenommen: 03. Mai 2023

Veröffentlicht: 11. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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